С. elegans Рассечение бластомеров: метод удаления яичной скорлупы и диссоциации эмбриональных клеток

Аннотация

Источник: Hsu, C. R., et al. in vitro восстановление пространственных контактных схем клеток с изолированными бластомерами эмбрионов Caenorhabditis elegans и адгезивными полистирольными шариками.J. Vis. Exp.(2019).

В этом видео представлен метод выделения бластомеров C. elegans из ранних эмбрионов. Полученные клетки пригодны для культивирования клеток или экспериментов ex vivo.

Протокол

Этот протокол представляет собой выдержку из Hsu et al, In Vitro Recreating of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads, J. Vis. Exp.(2019).

1. Выделение бластомера эмбриона
2. Наденьте перчатки и лабораторный халат, чтобы избежать порезов и контакта с отбеливающим раствором.
   1. Придерживайте каждый конец микрокапилляра (емкость; 10 мкл) правой и левой рукой.
   2. Потяните микрокапилляр к обоим концам, чтобы натянуть его, и переместите центр капилляра над горелкой, чтобы получился два капилляра, вытянутых вручную (Рисунок 1A).
   3. Обрежьте кончики вытянутых вручную капилляров щипцами под препарирующим микроскопом и прикрепите вытянутый капилляр к ротовому пипетирующему аппарату. Подготовьте два вида пипеток. Размеры отверстий кончиков пипеток должны быть приблизительно в 2 раза и в 1 раз больше длины короткой оси эмбрионов C. elegans (30 мкм) для переноса эмбрионов и удаления яичной скорлупы соответственно (рис. 1B-D).
   4. Пипеткой внесите 45 μл раствора яичной соли в лунку многолуночного предметного стекла (рис. 2A; дно).
   5. Поместите 5-10 взрослых особей C. elegans в лунку, содержащую раствор яичной соли.
   6. Чтобы получить ранние эмбрионы C. elegans, разрежьте взрослых особей на части, расположив две иглы справа и слева от тела C. elegans и проведя иглы друг мимо друга (рис. 2A; верхние схемы).
   7. Пипеткой нанесите 45 μл раствора гипохлорита в лунку рядом с лункой, содержащей раствор яичной соли (рис. 2B).
   8. Пипетка 45 мкл питательной среды Шелтона в последующие три лунки рядом с лункой, содержащей раствор гипохлорита (рис. 2B).
   9. Перенесите эмбрионы 1-клеточной стадии и ранней 2-клеточной стадии в раствор гипохлорита путем пипетирования через рот с помощью нарисованного вручную капилляра для переноса эмбрионов (Рисунок 2B).
   10. Подождите 40–55 с.
   11. Промойте эмбрионы путем переноса эмбрионов из раствора гипохлорита в питательную среду Шелтона путем пипетирования через рот с помощью нарисованного вручную капилляра для переноса эмбрионов (рисунок 2B).
   12. Снова промойте эмбрионы, перенеся эмбрионы в новую лунку питательной среды Шелтона с помощью перорального пипетирования с помощью нарисованного вручную капилляра для переноса эмбрионов (рисунок 2B).
   13. Перенесите промытые эмбрионы в новую лунку питательной среды Шелтона с помощью перорального пипетирования с помощью вручную нарисованного капилляра для переноса эмбрионов. Используя нарисованный от руки капилляр для удаления яичной скорлупы, осторожно повторите пипетирование (рисунок 2C; средние схемы). Если яичная скорлупа будет успешно удалена, эмбриональные клетки станут более сферическими (Рисунок 2C; справа).
   14. Отделите 2-клеточные эмбриональные бластомеры путем аккуратного и непрерывного пипетирования с помощью нарисованного вручную капилляра для удаления яичной скорлупы (Рисунок 2D).

Рисунок 1: Выделение бластомеров.(А) Ручное вытягивание стеклянного капилляра. (B) Нарисованный вручную стеклянный капилляр для переноса эмбрионов. (C) Нарисованный вручную стеклянный капилляр для удаления яичной скорлупы. (D) Схемы, показывающие подходящий размер капиллярного отверстия для удаления яичной скорлупы. Стрелками обозначены эмбрионы. Масштабные линейки показывают 100 мкм.

Рисунок 2: Рабочий процесс изоляции бластомеров.(А) Препарирование взрослых особей C. elegans в буфере с яичной солью для получения эмбрионов. На фотографиях показаны 2-клеточные и 4-клеточные эмбрионы до удаления яичной скорлупы. (В) Обработка и промывка гипохлорита. (C) На схемах показано подходящее время для удаления яичной скорлупы. На фотографии показан эмбрион на 4-клеточной стадии после удаления яичной скорлупы. (D) Отделение бластомеров. На фотографии показан отделенный эмбрион 2-клеточной стадии. Размеры стрелок в C и D указывают на относительные силы, необходимые во время пипетирования. Масштабные линейки показывают 50 мкм.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аспираторная трубка в сборе	Drummond	Для выделения бластомеров.
Caenorhabditis elegans: N2, дикий тип	Центр генетики канорхабдита	N2	Штамм, использованный в данном исследовании
Caenorhabditis elegans штамм: KSG5, генотип: zuIs45; itIs37	в доме	КСГ5	Штамм, использованный в данном исследовании
Калиброванный микропипетец, 10 μл	Драммонд	21-180-13	Для выделения бластомеров
CD липидный концентрат	Технологии Life	11905031	Для выделения бластомеров. Работа в вытяжке для культуры тканей.
Clorox	Клорокс	Н. А.	Для выделения бластомеров. Откройте новую бутылку, когда обработка гипохлоритом не работает должным образом.
Держатель защитного стекла	В доме	Н.А.	Для выделения бластомеров.
Препарирующий микроскоп: Zeiss Stemi 508 со стойкой M. Источником света является встроенный светодиод. Увеличение окуляра составляет 10X.	Карл Цейсс	Stemi 508	Для выделения бластомеров.
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, квалифицированный один выстрел, происхождение из Канады	Gibco	A3160701	Для выделения бластомеров. Работа в вытяжке для культуры тканей.
Иглы для подкожных инъекций общего назначения и прецизионного скольжения, 25 калибр	БД	14-826АА	Для выделения бластомеров
Инулин	Альфа Аэсар	AAA1842509	Для выделения бластомеров
Витаминный раствор MEM (100x)	Gibco	11120052	Для выделения бластомеров.
Multitest Slide 10 лунок	MP Biomedicals	ICN6041805	Для выделения бластомеров
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)	Gibco	15140148	Для выделения бластомеров.
Поливинилпирролидон	Биореагенты Фишера	БП431-100	Для выделения бластомеров
хлорид калия	Биошоп	ПК888	Для выделения бластомеров
Schneider's Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	Для выделения бластомеров. Работа в вытяжке для культуры тканей.
Хлорид натрия	Биошоп	СОД001	Для выделения бластомеров
раствор гидроксида натрия, 10 Н	Фишер Кемикал	СС255-1	Для выделения бластомеров
Шприцевые фильтры, ПТФЭ, нестерильные	Базикс	13100115	Для выделения бластомеров.
Tygon S3 Лабораторная трубка,, рецептура E-3603, внутренний диаметр 3.175 мм	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	Для выделения бластомеров.
Tygon S3 Лабораторная трубка,, рецептура E-3603, внутренний диаметр 6,35 мм	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	Для выделения бластомеров.

<тр > <-т >21-180-13 <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > » <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр >