С. elegans Анализ хемотаксиса: метод проверки хемоощущения у червей

Аннотация

Источник: Campbell, J. C., et al. A Caenorhabditis elegans Анализ отвращения к меди на основе пищевого статуса. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео знакомит с хемотаксисом у нематоды C. elegans и показывает протокол примера, проверяющий хемотаксическое отвращение к сульфату меди.

Протокол

Следующий протокол представляет собой выдержку из Campbell et al., A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aqusay Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Подготовка экспериментальных организмов
   1. Выберите 10 стадий нематод L4 для каждого штамма за 24 ч до начала анализа, чтобы убедиться, что микроорганизмы являются молодыми взрослыми особями на момент тестирования. Для каждой тестируемой мутантной или контрольной нематоды выберите 10 L4 (10 для контроля и 10 для анализа).
      1. Поддерживайте организмы L4 стандартными методами в течение 24 ч на стандартных агаровых планшетах, засеянных OP50 Escherichia coli. Если организмы теряются на последующих этапах промывки, компенсируйте это, увеличивая начальный размер выборки (т.е. выберите 20 червей, а не 10).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Поведение — это врожденно изменчивый фенотип. Выполняйте метод в трех экземплярах для каждого штамма в три отдельных дня. Включите дополнительные контрольные штаммы и условия для новых штаммов, как выделено в разделе обсуждения.
   2. Непосредственно перед анализом перенесите экспериментальные организмы в агаровую пластину без бактерий и дайте нематодам свободно перемещаться в течение 1 минуты, чтобы удалить избыток бактерий.
      1. Если экспериментальные организмы испытывали условия загрязнения в течение 24 часов до анализа, отбракуйте их.
   3. Нанесите пипетку 1 мл M9 на планшет без бактерий, чтобы смыть червей в микроцентрифужную пробирку.
   4. Центрифугируйте при 3 000 х г в течение 1 мин. Черви должны образовать гранулу на дне пробирки. Аспирация раствора М9 без разрушения гранул червяка. Добавьте 1 мл М9 в гранулу червяка, переверните трубку, чтобы смешать червей с раствором.
   5. Повторите шаги 1.4 еще три раза.
      1. Если избыток бактерий изначально перешел вместе с червями, повторите в общей сложности 5 раз. Никакие бактерии не должны переноситься на медные пищевые тарелки. Если пища будет перенесена на пробирную пластину, это помешает точному сбору данных.
   6. После окончательной промывки аспирируйте надосадочную жидкость до 100 μл M9 и остается гранула червяка.
      Внимание: Поведение, связанное с голоданием, становится очевидным через 30 минут. Следовательно, червей следует немедленно удалить из раствора после завершения этапов промывки.
2. Подготовка пробирных пластин
   1. Подготовьте стандартные агаровые планшеты NGM за два дня до анализа.
      1. Если пластины хранятся во влажной среде, сделайте агаровые пластины за 3 дня до анализа. В качестве альтернативы снимите крышку тарелки на 3 - 6 часов, чтобы обеспечить надлежащую сухость (если она находится в стерильной среде).
   2. Толстым перманентным маркером проведите линию на нижней стороне пластины вдоль внешнего края, а затем еще одну, чтобы сформировать барьер средней линии (Рисунок 1). Барьер средней линии должен быть равноудален от каждого края пластины. Используйте линейку для обеспечения точных измерений. Эти линии послужат ориентиром при переносе бактерий и медного раствора. При условии, что кишечная палочка переносится до раствора меди, эти линии будут служить индикаторами.
   3. Посевная пластина с 50 мкл OP50 E. coli только с одной стороны медного барьера для создания равномерного газона (Рисунок 2). Концентрация бактерий должна оставаться постоянной во всех анализах; Тем не менее, наблюдалась небольшая изменчивость в ответ на незначительные различия в концентрации.
      1. Используйте отмеченные линии на нижней стороне пластины, чтобы бактерии не контактировали с раствором меди. При условии, что раствор меди выстилает край пластины и образует барьер средней линии, перенесите бактерии таким образом, чтобы раствор меди не контактировал с источником пищи.
   4. Отметьте второй набор пластин и не переносите на них OP50 E. coli (рис. 2). Эти пластины послужат для оценки отрицательного контроля. Эти таблички также должны иметь маркировку на одной половине пластины, обозначающую начальное начало передачи.
   5. Дайте бактериям высохнуть, затем инкубируйте планшеты при температуре 37 °C в течение ночи. Убедитесь, что бактериальные пятна не потревожены при переносе в инкубатор или помещение с температурой 37 °C. Чрезмерное беспокойство может изменить расположение или форму грядки с едой.
3. Анализ хемотаксиса
   1. Свежеприготовьте 0,5 М раствор сульфата меди (II) до начала анализа. При условии, что на одну пластину используется 125 μL раствора, увеличьте этот объем в зависимости от количества используемых пробирных пластин (например, 5 пробирных пластин, 625 μL).
   2. Пипетируйте 100 мкл раствора сульфата меди (II) на край агара для создания внешнего медного барьера. Размеченная нижняя сторона пластины должна служить ориентиром.
   3. Пипетка 25 мкл раствора сульфата меди (II) для создания срединного барьера.
      1. Следите за тем, чтобы раствор сульфата меди (II) не соприкасался с бактериальным пятном. Используйте технику пятнистости, так как полосы могут повлиять на передвижение из-за вмятин/царапин на агаре.
   4. Дайте медному раствору высохнуть на пластине. Период времени может варьироваться в зависимости от планшета и лабораторных условий. Визуально проверяйте сухость каждые 5 минут после переноса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Медный раствор имеет голубоватый оттенок и легко идентифицируется. С помощью лабораторной салфетки слегка промокните раствор у края пластины, чтобы заметить сухость.
   5. Пипеткой нанесите 20 μл гранулы червя со дна пробирки на свободную от бактерий половину пластины для анализа.
      1. Убедитесь, что 10 червей перенесены на пробирную пластину. Если в тарелку случайно попали лишние черви, удалите их, обработав галоидоуглеродным маслом, чтобы убедиться, что на тарелку не добавлены бактерии. Каждый анализ должен иметь постоянное количество нематод во время анализа.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если во время анализов переносится слишком мало червей, увеличение исходного размера образца снизит потенциальные потери во время промывки и переноса.
   6. Удалите излишки М9 с планшета с помощью лабораторной салфетки. M9 не должен вступать в контакт с раствором сульфата меди (II).
      Внимание: Убедитесь, что черви и поверхность агара остаются нетронутыми во время выполнения этого шага. При слишком жестком использовании лабораторная ткань может создать углубления на поверхности агара пластины и удалить червей. Черви, случайно удаленные с помощью KimWipe, следует выбросить.
   7. После того, как раствор M9 был удален и все черви начали нежидкие локомоторные паттерны, запустите секундомер анализа.
      1. Оптимально удалить раствор M9 в течение минуты. Существенным параметром является выявление синусоидальной локомоции. Черви передвигаются иначе, например, молотящие, а не синусоидальные, когда находятся в жидкости. Запустите секундомер анализа, как только каждый из подопытных организмов перестанет биться.
   8. Проверяйте пробирные пластины каждые 30 минут.
      1. Для тестовых планшетов с бактериальными пятнами положительная оценка микроорганизмов, если они достигают пищевого пятна в течение 4 часов. Для отрицательных контрольных пластин положительная оценка организмов, если они пересекли барьер.

Результаты

Рисунок 1: Визуальное представление маркировки, обозначающей размещение медного раствора на нижней стороне чашки Петри диаметром 5 см. Эти показания используются для того, чтобы убедиться в том, что участки пластины были правильно измерены, и служат ориентиром при переносе бактериального пятна, а затем раствора меди на поверхность агара.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
M9 Solution [3 г KH2PO4, 6 г Na2HPO4, 5 г NaCl, 1 мл 1 M MgSO4, H2O на 1 литр. Автоклав для стерилизации перед использованием.]			Произведено в лаборатории
Сульфат меди	сигма	С-1297	Используйте воду для соответствующей суспензии до концентрации 0,5 М