$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол представляет собой выдержку из Turek et al, Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
1. Визуализация кальция
- Используйте трансгенные штаммы, экспрессирующие генетически кодируемые кальциевые сенсоры, такие как HBR16 (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
- Используйте составной микроскоп, предназначенный для широкопольной эпифлуоресценции. Подключите выход TTL камеры EMCCD к входу TTL светодиода, чтобы каждый раз, когда камера записывает кадр, образец подсвечивался. Используйте время воздействия около 5 мс. Используйте коэффициент усиления ЭМ в диапазоне 50 - 300.
- Укажите серийный видеоролик, идущий в течение 24 часов, при этом каждый червь визуализируется каждые 15–30 минут, сначала в течение 20 секунд с помощью DIC, затем в течение 20 секунд с флуоресценцией GFP для записи GCaMP, а затем сделайте окончательное изображение сигнала mKate2 для контроля уровней экспрессии. Используйте частоту кадров 2 в секунду во время каждой серии.
- Для визуального контроля данных используйте карту ложных цветов, чтобы улучшить видимость небольших изменений интенсивности флуоресценции. Отобразите флуоресцентные данные в виде ΔF/F, где F — среднее базовое значение флуоресценции. Подробное описание анализа данных по кальцию можно найти в литературе.