$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол взят из Teoh et al, Quantitative Approaches for Study Cellular Structures and Organella Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Количественная оценка мышечной структуры стенки тела
- Флуоресцентная визуализация мышечной структуры стенки тела
- Получите штамм (например, RW1596), несущий трансген stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006))), который маркирует миозиновые волокна GFP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Введение трансгена животным может быть достигнуто либо путем скрещивания интересующего штамма с животными, которые уже экспрессируют трансген, либо путем микроинъекции ДНК в дистальное плечо гонады. «Перекатывающийся» фенотип, индуцированный мутацией rol-6 в этом трансгене, облегчает визуализацию мышц. Мышцы стенки тела проходят вдоль спинной и вентральной сторон, которые обычно исключены из поля зрения у диких животных, потому что они обычно лежат на одной из их боковых сторон. Аллель rol-6(su1006) индуцирует скручивание животных, тем самым обнажая некоторые мышечные клетки для визуализации.
- Визуализируйте животных с помощью флуоресцентного микроскопа в сочетании с камерой с заряженной связью (ПЗС) высокого разрешения, объективом 40X или выше, фильтром GFP и программным обеспечением для сбора данных.
- Отрегулируйте время экспозиции и интенсивность освещения, чтобы предотвратить перенасыщение изображений.
- Захват и сохранение изображений мышц (400-кратное увеличение) из сечения животного, содержащего по крайней мере одну полную видимую косую мышечную клетку. Избегайте областей с одной неполной мышечной клеткой или секциями, которые не в фокусе. Также исключите изображения из крайних передних и задних областей, а также областей, прилегающих к вульве.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если у животного нет ни одной видимой полной мышечной клетки, осторожно сдвиньте покровное стекло, чтобы повернуть животное так, чтобы обнажить целую клетку.
- Измерение площади мышечных клеток
- Откройте изображение в программном обеспечении Fiji (версия 2.0.0 использовалась в этом исследовании).
- Используйте выделение полигона, чтобы аккуратно обвести вокруг одной косой мышечной клетки. Скорректируйте линию многоугольника в конце, перетащив точку привязки для улучшения трассировки.
- Перейдите на вкладку «Анализ» в верхней части программы и нажмите «Измерить», чтобы рассчитать площадь выбора. Будет показана отдельная таблица результатов, содержащая площадь и другие измерения. Если измерение площади отсутствует в таблице результатов, перейдите в раздел «Задать измерения» на вкладке «Анализ» и убедитесь, что установлен флажок «Площадь». Точно так же снимите флажки с других измерений, которые не нужны.
- Для мышечных клеток с вырожденной/отсутствующей областью обведите отсутствующую область с помощью инструмента выделения полигона и нажмите Измерить еще раз. Если в ячейке имеется несколько пропусков, обведите каждый из них отдельно.
- Рассчитайте отношение площади разрыва ко всей отдельной мышечной клетке. Высокий коэффициент указывает на более высокую степень мышечной дегенерации из-за больших промежутков внутри клетки. Если отсутствуют области, как это обычно наблюдается у диких животных, то соотношение будет рассчитано как ноль.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве контроля оценивайте также дефекты мышечной структуры визуально и сравнивайте результаты с количественным измерением. Это особенно полезно, если штамм впервые изучается в лаборатории. Для фенотипической оценки оцените животных как дефектных или недефектных на основе целостности филаментов. Например, животные с потерей отчетливых бороздок нитей, слипанием GFP или пробелами в мышечных клетках из-за структурного разрушения будут оценены как дефектные.