Эпидермальное лазерное ранение: индуцирование локализованного повреждения для изучения процессов восстановления у C. elegans

Аннотация

Источник: Xu, S. and Chisholm, A. D. Методы ранирования кожи и анализы для раневых реакций у C. elegans.J. Vis. Exp.(2014).

Это видео знакомит с методом лазерного ранения, который используется для нанесения очень точных повреждений эпидермиса червя. Пример протокола основан на исследовании реакции и заживления раны.

Протокол

Этот протокол представляет собой выдержку из Xu and Chisholm, Methods for Skin Wounding and Assay for Wound Responses in C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).

1. Лазерное ранение

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте фемтосекундное лазерное излучение (800 нм) для более точного ранения.

1. Приготовьте агаровые прокладки на предметном стекле с расплавленным 2% агаром. Убедитесь, что подушечки похожи на агаровые подушечки, используемые для визуализации C. elegans в реальном времени.
2. Переложите 10 молодых взрослых червей на агарозную подушечку с помощью червячной кирки и добавьте 2 мкл капли 12 мл раствора левамизола. Накройте животных и жидкость крышкой. Подождите 1-2 минуты, пока глисты не парализуются.
3. Поместите предметное стекло на вращающийся дисковый конфокальный микроскоп. Переместите предметную область, чтобы найти червей, и сосредоточьтесь на латеральном переднем или заднем синцитиальном эпидермисе с объективом 100X (NA 1,4-1,46).
4. Установите мощность фемтосекундного лазера на 140 мВт (измерена до объектива). Используйте фемтосекундный лазер с частотой следования 80 МГц.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Двух импульсов по 200 мсек каждый (с интервалом в 20 мс) достаточно для ранения в наши руки.
5. Сосредоточьтесь на апикальной поверхности клетки эпидермиса и раньте эпидермис. Наблюдайте местное нарушение цитоплазмы (пузырчатость) или локальное обесцвечивание любого используемого флуоресцентного маркера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте соответствующие процедуры безопасности при использовании фемтосекундного лазера. Линейное или точечное сканирование с использованием фемтосекундных лазеров, таких как в двухфотонных микроскопах><, должно обеспечивать достаточную мощность для лазерного ранения. ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя у нас нет непосредственного опыта использования других лазеров, в принципе ранение должно быть возможно с помощью обычных УФ-лазеров (как используется при абляции клеток C. elegans). По желанию, используйте модуль восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) на вращающемся диске конфокального для раны эпидермиса (N. Pujol, личное сообщение).