Кормление FITC-декстраном: метод количественной оценки проницаемости кишечника у C. elegans

Аннотация

Источник: Le, T. A. N., et al. Измерение влияния бактерий и химических веществ на проницаемость кишечника Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео представлен метод визуализации и измерения целостности просвета кишечника C. elegans путем кормления червей декстраном, меченным FITC. Пример протокола показывает анализ, проведенный с червями, обработанными 3,3'-дииндолилметаном (DIM) и откормленными патогенами.

Протокол

Этот протокол представляет собой выдержку из Le et al, Измерение влияния бактерий и химических веществ на кишечную проницаемость Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Подготовка планшетов NGM для тестирования влияния химического вещества (DIM) на проницаемость кишечника C. elegans, получавших P. aeruginosa
   1. Добавьте 0,5 г пептона, 0,6 г NaCl, 195 мл дистиллированной воды, магнитную мешалку и 6,8 г агара в стеклянный флакон объемом 500 мл (NGM агар).
   2. Добавьте 0,5 г пептона, 0,6 г NaCl, 195 мл дистиллированной воды и магнитную мешалку без агара в другую стеклянную бутылку объемом 500 мл (бульон NGM).
   3. Автоклавируйте две бутылки (на этапах 1.1–1.2), одну пустую стеклянную бутылку объемом 100 мл и одну пустую стеклянную бутылку объемом 500 мл в течение 15 минут при температуре 121 °C. Затем дайте содержащей среду бутылкам остыть до 55 °C на водяной бане в течение 30 минут. Держите агаровую среду на водяной бане и достаньте бутылку с бульоном (из шага 1.2) для следующего шага.
   4. В бульон NGM добавляют химические добавки: 0,4 мл 1 М CaCl₂, 0,4 мл холестерина в этаноле (мл), 0,4 мл 1 М MgSO₄ и 10 мл 1 М КПО₄ (все эти компоненты должны быть стерилизованы отдельно от холестерина в этаноле). Затем тщательно перемешайте смесь магнитной мешалкой при температуре 55 °C.
   5. Пометьте автоклавный пустой стеклянный флакон объемом 500 мл диметилсульфоксидом (ДМСО), а автоклавированный пустой стеклянный флакон объемом 100 мл — DIM.
   6. Перелейте 50 мл бульона NGM во флакон объемом 100 мл с маркировкой DIM. Добавьте в бутылку 500 μл 20 мМ запаса DIM и хорошо перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DIM растворяется в DMSO (20 mM DIM stock).
   7. Быстро снимите среду NGM агар с водяной бани, добавьте 50 мл среды NGM агар в бутылку с маркировкой DIM и тщательно перемешайте.
   8. Поместите 20 мл аликвоты DIM-содержащей среды NGM в каждую чашку Петри размером 90 мм x 15 мм. На этом этапе можно изготовить примерно пять DIM-содержащих пластин NGM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация DIM в каждой пластине NGM составит 100 μM.
   9. Чтобы приготовить планшет с ДМСО, содержащий НГМ, перелейте 150 мл бульона НГМ в бутылку объемом 500 мл с маркировкой ДМСО. Добавьте в бутылку 1,5 мл ДМСО и хорошо перемешайте.
   10. Добавьте 150 мл агаровой среды NGM во флакон с маркировкой DMSO и тщательно перемешайте.
   11. Поместите 20 мл аликвоты ДМСО-содержащей среды NGM в каждую чашку Петри размером 90 мм x 15 мм. На этом этапе можно изготовить примерно пятнадцать ДМСО-содержащих пластин NGM.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация ДМСО в каждой пластине NGM составит 0,5%.
   12. Затвердейте пластины при комнатной температуре не менее 3 часов и храните их при температуре 4 °C до использования><. ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.
   13. Извлеките культуру E. coli OP50 или P. aeruginosa PAO1 из холодильника при температуре 4 °C и тщательно переведите культуру в вихревой слой перед тем, как распределить по тарелкам NGM.
   14. Нанесите 800 мкл бактериальной культуры E. coli OP50 или P. aeruginosa PAO1 на каждую свежую чашку с агаром NGM и дайте пластинам высохнуть в инкубаторе при температуре 20 °C в течение ночи><. ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол здесь можно приостановить. Для третьего эксперимента (рис. 1) были получены две ДМСО-содержащие НГМ-пластины, покрытые живой E. coli OP50, одна ДМСО-содержащая НГМ-пластина, покрытая живым P. aeruginosa PAO1, и одна DIM-содержащая НГМ-пластина, покрытая живым P. aeruginosa PAO1.
2. Лечение от бактерий или кормление DIM и FITC-декстрана
   1. Синхронизированные по возрасту яйца инкубируют при температуре 20 °C в течение 64 ч на планшетах NGM с добавлением живой E. coli OP50 в качестве корма.
   2. Промойте синхронизированную по возрасту личинку L4 с S-буфером и перенесите их (более 500 червей) на планшеты NGM, содержащие различные бактерии и химические вещества. Инкубируйте их при температуре 20 °C в течение 48 ч.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Время обработки может варьироваться от 24 до 72 часов, в зависимости от используемых бактерий и химикатов. Терапевтический или профилактический эффект DIM также можно оценить путем предварительной обработки червей патогенами и последующей обработки червей DIM (терапевтический эффект) или предварительной обработки червей DIM и последующей обработки патогенами (профилактический эффект).
   3. Для приготовления планшетов с добавкой FITC-декстрана смешайте 2 мл инактивированной при нагревании E. coli OP50 с 4 мг FITC-декстрана. Затем разделите 100 μL смеси FITC-декстрана и E. coli OP50 на двадцать свежих агаровых пластин NGM (60 мм x 15 мм) и дайте пластинам высохнуть в течение 1 часа на чистом скамейке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация FITC-декстрана в каждой пластине NGM составит 20 мкг/мл.
   4. Подготовьте пять пластин NGM, содержащих E. coli OP50, без FITC-декстрана для обработки транспортного средства. Для этого разделите 100 мкл инактивированной при нагревании E. coli OP50 на каждую свежую пластину агара NGM (60 мм x 15 мм) и дайте пластинам высохнуть в течение 1 часа на чистом скамейке><. ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого независимого эксперимента требуется пятнадцать пластин NGM, дополненных FITC-декстраном, и пять пластин NGM без FITC-декстрана.
   5. Через 48 ч обработки (начиная с шага 2.2) промойте червей S-буфером, переложите червей в планшеты с добавкой FITC-декстрана и планшеты NGM без FITC-декстрана и инкубируйте планшеты в течение ночи (14–15 ч).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой группы обработки требуется 5 повторений окрашивания FITC-декстрана (или контрольного кормления транспортным средством).
   6. Промойте червей с помощью S-буфера и дайте им проползти в свежей агаровой пластине NGM в течение 1 ч.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого независимого эксперимента требуется в общей сложности 20 свежих пластин NGM. На этом этапе вы можете использовать пластину NGM без или с E. coli OP50.
   7. Добавьте 50 мкл 4% раствора формальдегида в каждую лунку черной 96-луночной пластины с плоским дном. Перенесите около 50 червей с каждой пластины NGM в каждую лунку для измерения флуоресценции. Через 1-2 минуты тщательно удалите весь формальдегид из каждой лунки и добавьте 100 μL монтажной среды для покрытия лунок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор формальдегида (4%) используется для обездвиживания и фиксации червей. Для каждой группы лечения используется 5 лунок (5 повторов) для анализа изображений.
3. Визуализация C. elegans с помощью системы визуализации оперетты и определение проницаемости кишечника путем измерения поглощения флуоресценции FITC<br /> ПРИМЕЧАНИЕ:Флуоресцентная стереомикроскопия может использоваться для анализа изображений вместо системы оперетты.
   1. Захватывайте флуоресцентные изображения и измеряйте интенсивность флуоресценции с помощью системы визуализации Operetta High-Content Imaging System, а также анализируйте изображения с помощью программного обеспечения Harmony.
   2. В программном обеспечении Harmony нажмите значок «Открыть крышку», чтобы открыть крышку и поместить пластину в машину.
   3. Настройте параметры.
   4. Нажмите кнопку Настроить (Setup), выберите тип пластины (96-луночный Corning flat-bottom) и добавьте каналы (каналы светлого поля и каналы EGFP).
   5. Настройте макет. Перейдите в раздел Компоновка, а затем выберите Трек и настройте параметры (первая картинка на 1 мкм, количество плоскостей 10, расстояние 1 мкм).
   6. Выберите одну из лечебных лунок и одно поле захвата и нажмите кнопку Тест, чтобы проверить удовлетворительность снимков в разделе Запуск эксперимента.
   7. Если снимки устраивают, вернитесь в раздел «Настройка» и нажмите значок «Сброс» в конце экрана. Затем выберите все целевые скважины и подходящее количество полей захвата.
   8. Снова перейдите в раздел Запустить эксперимент и введите имя пластины, затем нажмите Старт, чтобы начать обработку.
   9. Чтобы измерить интенсивность флуоресценции, перейдите в раздел анализа изображения и введите изображение. Найдите ячейку, выбрав канал EGFP и метод B. Установите общий порог на 0,5, площадь на >200^мкм2, коэффициент разделения на 3,0, индивидуальный порог на 0,18 и контраст на более чем 0,18. Затем рассчитайте свойства интенсивности и выберите среднее значение в качестве выходных данных. Нажмите значок «Применить», чтобы сохранить настройки.
   10. Перейдите в раздел «Оценка», чтобы измерить интенсивность, получив тепловую карту и таблицу данных. Установите параметр Считывание в значение Cells — Intensity Cell EGFP Mean — Mean per Well и начните оценку.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.
   11. Чтобы извлечь данные из оперетты, нажмите кнопку «Настройка» и выберите «Управление данными».
   12. Выберите Записать архив, а затем откройте обзор и выберите файл.
   13. Чтобы выбрать файл, нажмите маленький сигнал + в левом углу, а затем нажмите «Измерение» и выберите «Имя пластины».
   14. Выберите файл и нажмите OK.
   15. Выберите путь для сохранения файла, щелкнув сигнал «Обзор» по активному пути.
   16. Нажмите кнопку Пуск, чтобы сохранить файл данных.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.
4. Статистический анализ флуоресценции FITC-декстрана C. elegans
   1. Импортируйте данные и рассчитайте среднее значение и стандартное отклонение (SD) с помощью статистического программного обеспечения.
   2. Проанализируйте значимую разницу с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественного сравнения Тьюки.

Результаты

Рисунок 1: Влияние DIM на проницаемость кишечника C. elegans, которых кормили P. aeruginosa.Микроскопические изображения червей (A) E. coli OP50 без FITC-декстрана, (B) E. coli с FITC-декстраном, (C) P. aeruginosa PAO1 с FITC-декстраном и (

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сигма	D9568
90×15 мм	SPL Life Sciences, Южная Корея	10090
Бактор Агар	Бектон Дикинсон	КОД 214010
Раствор формальдегида	сигма	Ф1635
Caenorhabditis elegans N2	Центр генетики ценорхабдита (CGC)		Дикий тип
Холестерин	сигма	С3045
Пробирная пластина Costa, 96 лунка черная с прозрачным плоским дном необработанная, без крышки из полистирола	Корнинг Инкорпорейтед	ССЫЛКА 3631
диметилсульфоксид	сигма	Д2650
Escherichia coli OP50	Центр генетики ценорхабдита (CGC)
Флуоресцеин изотиоцианат - декстран	сигма	ФД10С
Harmony	ПеркинЭлмер		Версон 3.5
Гептагидрат сульфата магния	Биореагенты Фишера	БП2213-1
Fluoromount	сигма	Ф4680
Operetta CLS High-Content Analysis System	ПеркинЭлмер	HH16000000
Пептон	Мерк	ЭМД 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Корейская коллекция для шрифтовой культуры	ККСТ NO 1637
Хлорид натрия	Биореагенты Фишера	БП358-1
Стереомикроскоп	Nikon, Япония	SMZ800N