$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Следующий протокол является выдержкой из Farboud et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp.(2018).
1. Сборка RNP
- Планируйте эксперимент заранее, заранее получая все компоненты РНК, ДНК и белка. В качестве первого прохода попробуйте один из положительных контрольных показателей, перечисленных в таблице 1, и используйте коммерческие реагенты, описанные в таблице материалов, чтобы обеспечить надежный экспериментальный дизайн и целостность материалов. Дополнительные советы по планированию нового эксперимента по редактированию генома см. в статьях на эту тему.
ПРИМЕЧАНИЕ: После сборки, как описано на последующих этапах, заранее подготовленные RNP могут храниться при температуре -80 °C.
- После выбора гена для нацеливания, используйте один из бесплатных онлайн-инструментов для разработки оптимальной гРНК. Обязательно нацельтесь на экзон, если надеетесь сгенерировать нокаут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти инструменты помогут идентифицировать целевой сайт с соседней последовательностью PAM S. pyogenes, высоким качеством оценки и низкой оценкой за пределами цели.
- Очистите белок Cas9 от S. pyogenes с помощью опубликованных методов или приобретите его у коммерческого поставщика.
- Приготовьте типичный буфер Cas9 для разведения РНК, получения РНП и хранения белка, который содержит 20 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ KCl, 10% глицерина и 1 мМ TCEP. Всегда используйте воду без нуклеаз в буферах, которые будут использоваться для ресуспендирования или разбавления РНК для предотвращения деградации.
- Получите направляющую РНК (тракрРНК и крРНК или sgРНК) с помощью транскрипции in vitro с использованием опубликованных методов или приобретите ее у компании по синтезу нуклеиновых кислот.
- Если вы вставляете ген, синтезируйте или приобретайте шаблон донорской ДНК.
- Храните аликвоты белка и РНК при температуре -80 °C и размораживайте на льду непосредственно перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое замораживание-оттаивание немного снижает эффективность. Подробные протоколы открытого доступа для очистки Cas9 и транскрипции sgРНК in vitro доступны в других источниках.
- Подготовка РНП для редактирования C. elegans: Соберите комплекс РНП путем добавления следующих реагентов для создания конечного объема 20 мкл (конечные концентрации указаны в скобках): Cas9 (2 мкМ), HEPES pH 7,5 (10 мкМ), KCl (115 мкМ), крРНК (12 мкМ), тракрРНК (40 мкМ), и, при необходимости, шаблоны для репарации (0,5 мкМ ссДНК или до 350 нг/мкл дцДНК).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность Cas9-опосредованной DSB-шаблонной репарации пропорциональна концентрации конструкции репарации dsDNA; Таким образом, чем выше концентрация шаблона ремонта, тем эффективнее шаблонный ремонт. Тем не менее, было показано, что инъекция смесей, содержащих более 350 нг/мкл дцДНК, снижает жизнеспособность введенных червей. Таким образом, лучше всего использовать до, но не более 350 нг/мкл дцДНК в смеси, чтобы максимизировать эффективность репарации при минимизации ее летальности.
- Добавьте несколько crРНК для одновременного нацеливания на несколько локусов, как это необходимо для скрининга co-CRISPR/co-conversion. При добавлении более одной crRNA добавьте каждую последовательно в мастер-микс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество каждой crRNA не обязательно должно быть одинаковым, и даже удвоение общей концентрации crRNA в мастер-миксе без изменения концентрации Cas9, по-видимому, не влияет на частоту мутагенеза в конкретном локусе. Примеры подробно описаны в Paix et al.
- Перемешайте с помощью пипетирования и вращайте раствор RNP при давлении 16 000 x g в течение 5 с, чтобы убедиться, что раствор собирается на дне пробирки.
- Инкубируйте раствор при 37 °C в течение 15 м.
- Центрифугируйте образец при давлении 16 000 x g в течение 1 минуты, чтобы удалить любые частицы, которые могут закупорить иглу для микроинъекций с тонким отверстием. Используйте надосадочную жидкость на последующих этапах.
- Приготовление C. elegans
1. За 1 день до микроинъекции: Подготовьте агарозные прокладки для микроинъекции.
- Приготовьте 3% (по массе) раствор агарозы в воде, добавив агарозу в воду и доведя раствор до кипения на горячей плите или в микроволновой печи.
- Разложите на столе предметные стекла размером 24 мм x 50 мм x 1,5 мм и с помощью стеклянной пипетки Пастера поместите небольшую (~15 μл) каплю раствора агарозы на предметное стекло. Быстро разровняйте агарозную каплю, положив сверху еще одну покровную каплю. Дайте агарозе застыть, а затем снимите одну из покровных стекол.
- Оставьте покровное стекло с агарозным покрытием лицевой стороной вверх на столе на ночь для высыхания. Через 24 часа храните агарозные подушечки в чистом сухом контейнере><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Их можно использовать бесконечно.
2. Потяните иглы для микроинъекций: используя капилляры из боросиликатного стекла с нитями (внешний диаметр 1,0 мм и внутренний диаметр 0,58 мм), вытяните иглы на основе Mello и Fire57 и других ресурсов. Иглы можно использовать сразу или хранить в чистой, сухой емкости, укрепленной глиняными опорами.
3. Для содержания червей приготовьте агар Nematode Growth Media (NGM), налитый в пластины Петри и покрытый бактериями OP50 (протоколы по стандартному содержанию C. elegans и рецепты питательных сред см. в Stiernagle).
4. Подготовка червей для микроинъекции: за 12-24 часа до микроинъекции выберите L4-стадию гермафродитов в новую NG-агаровую пластину с бактериями OP50 и инкубируйте их в течение ночи при 20 °C. Для каждой мишени/инъекционной смеси Cas9 выберите ~30 червей на тарелку.
- День микроинъекции: Загрузите в иглу для микроинъекций надосадочную жидкость раствора RNP, приготовленную на шаге 1.2.
- Пипетку надосадочную жидкость из шага 1.2.4 ввести в вытянутую капиллярную пипетку и заполнить раствор из капиллярной пипетки в подготовленную иглу для микроинъекций (обычно с нагрузкой менее 0,1 мкл).
- Установите заряженную иглу на аппарат для микроинъекций, прикрепленный к микроманипулятору. Установите давление в инжекторном аппарате на 250 кПа, а на балансовое давление — на 25 кПа.
- Сломайте заряженный кончик иглы, чтобы получить острый край иглы. Поместите квадратный покровный колпачок размером 15 мм x 15 мм x 1,5 мм на верхнюю часть покровного стекла размером 24 мм x 50 мм x 1,5 мм.
- Один край квадратного покровного стекла обмазать галоидоуглеродным маслом 700.
- Поместите иглу в масло на край квадратного покровного стекла толщиной 15 мм.
- Используя руку для управления предметным столиком микроскопа и покровным стеклом, проведите предметным стеклом вверх и вдоль края иглы, одновременно нажимая педаль/кнопку инъекции. Отломите кончик иглы назад, увеличивая отток жидкости из иглы. Добейтесь оптимальной скорости потока, заставив инъекционную смесь течь вверх по краю иглы, образуя ~1 пузырь/с.
- Подтвердите, что черви L4, выбранные за 12-24 часа до микроинъекции, являются молодыми взрослыми на стадии развития в день инъекции. Соберите молодых взрослых червей на NG-агаровую пластину, в которой отсутствуют бактерии OP50, и дайте им ползать вокруг в течение 5 минут. Это уменьшает количество бактерий, переносимых на инъекционную подушечку, сводя к минимуму засорение иглой.
- Поместите агарозную инъекционную прокладку/покровное стекло на эндоскоп для вскрытия. С помощью червячной кирки проложите небольшую дорожку из галоидоуглеродного масла вдоль одного края прокладки.
- Используя червячную кирку, покрытую маслом, снимите несколько червей с пластины NG-агара и поместите их в масляную дорожку. С помощью тонкого волоска, прикрепленного к пипетке, например, ресницы или кошачьего уса, расположите червей параллельно, осторожно проталкивая червей в агарозную подушечку. До тех пор, пока вы не освоитесь с процедурой микроинъекции, садитесь и вводите только одного червя за раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сухая агароза будет отводить влагу от червей, заставляя их прилипать к подушечке. Следовательно, работать нужно быстро, так как черви могут высохнуть.
- Оказавшись на месте и прикрепив его к подушечке, нанесите на червей еще несколько капель галоидоуглеродного масла (~20 мкл) с кончика червячной кирки.
- C. elegans Gonad Microinjection with RNP and Post-injection Care
Протокол микроинъекций адаптирован из Mello and Fire и подробно описан в других источниках.
- Поместите покровное стекло с установленными червячками на инъекционный микроскоп. При малом увеличении (объектив 5X, окуляр 10X) расположите червей перпендикулярно игле для инъекции.
- Переключитесь на большое увеличение (объектив 40X, 10-кратный окуляр), переместите иглу, прилегающую к плечу гонады, соответствующей области рядом с ядрами в средне- и позднем пахитене.
- С помощью микроманипулятора переместите иглу против червя, слегка надавливая на кутикулу. Затем одной рукой постучите по боковой стороне предметного стекла микроскопа, чтобы встряхнуть иглу через кутикулу. Нажмите педаль/кнопку инъекции и медленно заполните плечо гонады смесью для инъекций и извлеките иглу.
- Повторите этот шаг с другим плечом гонад.
- После того, как черви будут введены, снимите покровную прокладку/агарозную прокладку и поместите ее под препарирующий микроскоп.
- С помощью вытянутой капиллярной пипетки вытесните масло из червей, наложив на них пипетирование буфера M9. Выполняйте эту обработку, чтобы освободить глистов от агара.
- Через 10 минут, когда черви начнут метаться в буфере, переместите их на NG-агаровую пластину с бактериями OP50 с помощью вытянутой капиллярной пипетки. Поместите пластину при температуре 20 °C на 2-3 часа, пока черви не восстановятся и не начнут двигаться.
- После восстановления по отдельности перенесите червей в планшеты с NG-агаром с OP50 и перенесите планшеты в инкубатор с температурой 25 °C.
- Дайте введенным P 0 червям вырасти и отложите потомство в течение 3 дней. Отсейте потомство F1.
- Если используется ко-CRISPR или ко-конверсия, то выбирайте червей-кандидатов для скрининга на основе того, имеют ли они мутантный фенотип референсного гена. По отдельности перенесите этих помеченных червей на новые NG-агаровые планшеты с OP50 и дайте им отложить потомство F2 при 20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фенотип, используемый для скрининга или отбора co-CRISPR, должен обеспечить раннюю оценку успеха редактирования Cas9.
- Если фенотип ко-CRISPR отсутствует, введите микроинъекцию положительной контрольной плазмиды, чтобы повысить эффективность микроинъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, включение плазмиды в смесь для инъекций, которая кодирует MYO-2 с меткой mCherry, поможет оценить эффективность инъекции. У червей, успешно введенных pCFJ90, будет некоторое потомство с флуоресцентными глотками.
- Изучите червей F1 на наличие желаемых правок. Выберите мать F1 в отдельную лунку из 96-луночного планшета, лизируйте ее и исследуйте ее ДНК с помощью ПЦР-амплификации, анализа последовательности ДНК или анализа, проводимого с помощью нуклеазного анализа (CEL-1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти анализы могут быть выполнены при использовании ко-CRISPR/ко-конверсии или других режимов скрининга или отбора.
