УФ-облучение: метод интеграции внехромосомных решеток

Аннотация

Источник: Mariol, M. C et al. A Rapid Protocol for Integration Extrachromosomal Array with High Transmission in the C. elegans.J. Vis. Exp.(2013).

Микроинъекция трансгенов обычно приводит к получению штаммов C. elegans с большими внехромосомными массивами, что приводит к переменной экспрессии и передаче трансгена. УФ-излучение может индуцировать хромосомную интеграцию массива и более стабильную трансгенную передачу.

Протокол

Этот протокол является выдержкой из Mariol et al, A Rapid Protocol for Integration Extrachromosomal Arrays with High Transmission Rate into the C. elegans Genomes, J. Vis. Exp.(2013).

1. УФ-облучение и восстановление трансгенных червей

1. Облучение червями:
   1. Соберите 30-100 флуоресцентных трансгенных животных L4 на отдельные культуральные планшеты (по 15-20 животных на планшет).
   2. Поместите пластины со снятыми крышками в УФ-сшиватель. Облучайте червей со скоростью 0,012 Дж/^см2. Обратите внимание, что штаммы более или менее чувствительны к ультрафиолетовому излучению, и что результаты могут варьироваться в зависимости от используемого УФ-облучателя. Можно протестировать диапазон доз от 0,010 до 0,015 Дж/^см2.
2. Восстановление глистов после облучения:
   1. Поместите пластины с облученными червячками на ночь при температуре 15 °C для восстановления.
   2. Проверьте количество животных, которые остались в живых. В наших руках выживаемость составляет около 80-90% для эффективного облучения.
   3. Облучаемых животных выращивают при температуре 15-25 °C до тех пор, пока потомство не достигнет стадии развития, позволяющей наблюдать за экспрессией маркера коинъекции.

2. Выделение интегрированных трансгенных линий

1. Выбор животных F1:
   1. Одиночные 150-200 флуоресцентных животных F1 на отдельных культуральных планшетах. Для высокопередающих линий (≥80%) достаточно 100 животных F1.
   2. Держите эти планшеты F1 при температуре 15-25 °C до тех пор, пока потомство не достигнет подходящей стадии для наблюдения за флуоресцентными животными F2.
   3. Отбросьте все пластины F1, на которых либо i) отсутствует потомство, указывающее на то, что животное F1 было стерильным или умерло, либо ii) отсутствуют или только несколько флуоресцентных животных F2, указывающие на то, что животное F1 не передавало трансген с ожидаемой скоростью. Этот шаг является быстрым и представляет собой реальное преимущество по сравнению со стандартным протоколом, который требует оценки процента флуоресцентных червей F2 для выбора планшетов F1 с ≥75% флуоресцентного потомства (Таблица 1).
2. Выбор животных F2:
   1. По одному четырем флуоресцентным трансгенным животным F2 из каждой выбранной пластины F1. При использовании флуоресцентных трансгенов (например, mCherry, gfp или dsRed) выбирайте червей F2 с высоким уровнем флуоресценции, так как это может указывать на то, что эти животные гомозиготны для интегрированного массива. Обратите внимание, что при отборе животных F2 крайне важно не носить с собой яйца или личинки, чтобы избежать ложноотрицательных результатов на следующем этапе.
   2. Выращивайте животных F2 при температуре 15-25 °C.
3. Выделение и валидация интегрированных трансгенных штаммов:
   1. Экранируйте планшеты F2 на наличие 100% флуоресцентных трансгенных червей F3. Экран работает довольно быстро, так как наличие одного нефлуоресцентного червя указывает на то, что пластину следует выбросить. Животное F2, гомозиготное по интегрированному трансгену, даст 100% гомозиготное флуоресцентное потомство.
   2. Выделение восьми флуоресцентных животных F3 из выбранных планшетов для подтверждения 100% наследования трансгена. По идее, на этом этапе достаточно выбрать одно животное. Тем не менее, выбор восьми флуоресцентных животных F3 может быть необходим, чтобы избежать отбора бесплодных или нездоровых животных, поскольку облучение может случайным образом вызвать мутации, влияющие на гены, важные для физиологии червей.
   3. По возможности сохраняйте несколько независимых интегрированных трансгенных штаммов, т.е. штаммов, полученных от разных животных F1.

Результаты

Таблица 1. Сравнение стандартного и улучшенного протоколов интеграции внехромосомных матриц в геном C. elegans.Два неинтегрированных трансгена, передающих примерно с одинаковой частотой, были интегрированы с использованием стандартного или усовершенствованного протокола. Основное отличие заключается в том, что в стандартном протоколе проводится скрининг потомства...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Длина волны 254 nm
Микроскоп SteREO Discovery V8	Карл Цейсс, Инк.
чашки Петри, 60 мм	ХМЛ	BPS55E6
Платиниевый провод 0.25 мм	Альфа Аэсар	6/4/7440	Чтобы сделать кирку для червей