Обратный генетический подход для тестирования функциональной избыточностью во время эмбриогенеза

Краткое содержание

Гена функция может быть скрыта в связи с потерей функции эксперименты, если есть возмещение другого гена. Модель данио обеспечивает относительно высокую пропускную способность средств выявить такие функциональной избыточностью в живых эмбрионов.

Аннотация

Гена функции во время эмбриогенеза, как правило, определяется с потерей функции экспериментов, например, путем направленного мутагенеза (нокаут) в мышь. В данио модель, эффективная обратная генетические методы были разработаны с использованием микроинъекции генов конкретного morpholinos антисмысловых. Morpholinos целевой мРНК с помощью конкретных спариванием оснований и функциональных блоков генов временно, подавляя перевод или сплайсинг в течение нескольких дней во время эмбриогенеза (нокдаун). Тем не менее, у позвоночных, таких как мышь или данио, некоторые гена функции могут быть скрыта этих подходов в связи с присутствием другого гена, который компенсирует потери. Это особенно верно для генов семейств, содержащих сестра генов, которые совместно выраженных в той же самой развивающейся ткани. В данио, функциональной компенсации может быть проверена в относительно высокой пропускной образом, путем совместного введения morpholinos этой цели нокдаун обоих генов одновременно. Аналогично, используя morpholinos, генетического взаимодействия между любыми двумя генами можно продемонстрировать на нокдаун оба гена вместе на суб-пороговые уровни. Например, morpholinos можно титровать, что ни отдельные нокдаун формирует фенотип. Если в этих условиях, со-инъекции как morpholinos причины фенотипа, генетической взаимодействие показано на рисунке. Здесь показано, как показать функциональной избыточностью в контексте двух взаимосвязанных факторов транскрипции GATA. GATA факторы имеют важное значение для спецификации сердечной предков, но это проявляется только потеря обеих Gata5 и Gata6. Покажем, как провести микроинъекции эксперименты, проверять morpholinos, и оценивать фенотип компенсацию за cardiogenesis.

Протокол

Наша цель заключается в проверке функциональной избыточности двух факторов транскрипции для уточнения кардиомиоцитов прародителей. Факторы кодируются двух связанных генов gata5 и gata6, и мы используем данио модель, чтобы понять их относительной функции ^1. Наша стратегия состоит в блокировании гена функции, используя morpholinos ^2. Мы будем вводить morpholinos для одного или другого гена в оплодотворенные яйцеклетки, и сравнить эмбрионального фенотипа с эмбрионами основе яйца вводят одновременно с обеих morpholinos. Для упрощения оценки фенотипов, мы используем яйца производным от рыб, которые несут трансгенов, что выражает GFP в кардиомиоциты.

Шаг 1. Подготовка к микроинъекции.

) Создание размножающихся пар рыбы

Вечером перед инъекцией, один мужской и один женский взрослых рыб (3-18 месяцев) расположены попарно в заводчика танков, разделенных разделителем до следующего утра. Как правило, мы создали 10-20 пар рыб, и они соединяются раз в неделю, независимо от того, яйца будут использованы для поддержания плодородия. Для этого эксперимента мы используем репортер напряжение, трансгенных по cmlc2: EGFP, потому что она обеспечивает простое считывание для выявления дифференциации кардиомиоцитов. На следующее утро, как только свет включен, вода изменилась, и перегородки вытащил из танка позволяет рыбе пар для спаривания и производства яиц. Производство яиц можно контролировать, и может начать немедленно, либо после периода час или больше, в зависимости от рыбы. Как правило, примерно через 20 минут непрерывной спаривания, яйца собираются с помощью пипетки или сито и выливают в 100 мм чашках Петри содержащие воды в системе. Важно контролировать производство яиц для того, чтобы гарантировать, что эмбрионы вводят между 1-4 клеточной стадии. Выпустив несколько пар одновременно, то можно поразить производства яиц и таким образом максимизировать количество яиц, которые могут быть введены на ранней стадии развития. Хорошая пара рыбы могут генерировать более 200 эмбрионов, и это не имеет никакого практического смысла собирать тысячи яиц, в то же время, так как один следователь не сможет придать их достаточно быстро, до того как они за 4-клеточной стадии . Рыба стимулируются разводить на свет цикла, так что это эксперимент, который требует скорейшего начала и яйца обычно не получены после полудня.

В) Подготовка иглы

1. Используйте Puller микропипетки и 3,5 "стеклянный капилляр для создания двух игл, используя следующие условия: тепло = 626, Pull = 60, скорость = 60, и Время = 250 мы используем открытые иглы ядро, которое не содержит нити, потому что. мы передней наполнить их всасывания.
2. Кончике каждой иглы затем аккуратно сломанной используя чистую лезвия бритвы или пинцетом, а затем и скошенным на угол 30 градусов в течение примерно 20 секунд, используя EG-4 микро-мясорубки. Это обостряет наконечник и важно, если Вы вводите через хориона.
3. Важно получить последовательным иглы диаметром кончика размером около 15 микрон (калиброванный как 4 установок, работающих на сетке окуляра микроскопа, чтобы иметь возможность калибровки 1-2 инъекции п объема).
4. Иглы должны быть подготовлены заранее, безопасно хранить в безопасном месте, и каждый индивидуально калибруются непосредственно перед началом инъекций обеспечить постоянный объем впрыска (см. раздел D право). Если вам повезет, вы сможете использовать одну иглу для всего эксперимента. Тем не менее, игла может легко сломаться в середине эксперимента, и вы не хотите, чтобы использовать это время тянуть новые иглы.

C) Создание инъекции пластин

1. Подготовка 100 мл 2% агарозном решения в системе водоснабжения, кипячением в микроволновой печи.
2. Прохладный на ощупь, и залейте приблизительно 12 мл на перевернутую крышку 100 мм чашки Петри.
3. Вставьте 2 предметные стекла, наклонные примерно в 45 градусов, в две стороны крышки. После агарозном укрепил, осторожно потяните два слайда от крышки.
4. Это создает желоба, где эмбрионы будут размещены, а затем вводили. Несколько пластин могут быть подготовлены заранее. Они могут храниться бесконечно при 4 ° С после добавления слоя на 70% этанола, добавив нижней части оригинальной пластинки, и уплотнения парафильмом. Не забудьте хорошо промыть перед использованием.

D) станции Микроинъекция и игл калибровки

1. Включите источник сжатого азота и PLI-100 microinjector. Инжектора должна быть скорректирована на постоянное давление потока до 18 PSI.
2. Прежде чем вставить иглу, уверяют, что микроманипулятора находится в правильном положении, чтобы широкий диапазон движений, и что вставляется игла не ударит таблице. Вставьте один изиглы подготовленные ранее (см. раздел С) в микроманипулятора убедившись, есть уплотнения. Будьте осторожны, чтобы не сломать иглу.
3. Обратите внимание на кончике иглы под микроскопом, чтобы убедиться, что он не засорен прежде чем приступить к калибровке.
4. Место падения (2-3 мкл) раствора для инъекций или DDH ₂ O на небольшой кусочек парафильмом и заполнить около 1,5 мкл, потянув ее на иглу с помощью заливки кнопку. Будьте уверены, что у вас есть иглы полностью в раствор, и наблюдать жидкости всасывания через микроскоп, чтобы не привлекать в любом пузырьки воздуха.
5. Место каплю минерального масла на сетку микрометра.
6. Отрегулируйте эмпирически время инъекции, чтобы размер капли составляет примерно 1,5 микрона в диаметре. Это доставит инъекции объемом ~ 1,8 п. Фактический объем может быть настроен на ваш выбор, но в практическом смысле это очень трудно точно откалибровать объемы ниже 1 п, и эмбрионы могут не переносить объемы свыше 2 п. Независимо от объема размер вы ни выбрали, имейте это же для всех инъекций в том числе контроля, а также настроить концентрации раствора (а не объемом впрыска) для титрования количество впрыскиваемого морфолино.
7. Межповерочный необходимо каждый раз игла заменена, так как размер иглы будет меняться.

Шаг 2. Проверка morpholinos ориентации двух различных генов

Morpholinos, предназначены для сайта инициации трансляции или сращивания участков целевой мРНК тем самым блокируя синтез белка или соответствующей обработки мРНК. При анализе гена в первый раз, мы используем оба типа morpholinos для проверки, если они порождают тот же фенотип, указывая конкретных нокдаун. Преимущество сращивание-блокатор, что вы можете проверить нокдаун нормальной стенограмму ОТ-ПЦР, что особенно полезно, если антитела для целевого гена отсутствуют. Мы будем показать, как последовательное сердечной фенотипа достигается при gata5 и gata6 генов использованием morpholinos (gata5 5'UTR МО последовательности: 5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3 '; gata5 сращивания сайта МО последовательности: 5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3'; gata6 5 "УТР МО последовательности: 5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3 ').

1. Morpholinos получаются из генов Tools, LLC (Филомат, ИЛИ). Гена инструменты помогут вам выбрать лучший последовательности к цели, если вы спросите их вспомогательного персонала. Вам нужно только отправить их регистрационный номер, и они будут советовать. Тем не менее, нет никакой гарантии, что морфолино будет работать, и именно поэтому вы должны быть готовы для проверки деятельности. Вы также можете проверить, если морфолино можно получить OpenBiosystems. Гена Инструменты включает запасы синтезированы morpholinos к OpenBiosystems. В то время как раз никакой гарантии, что будет работать, они продают меньших количествах по более низкой цене, которая может помочь покрыть расходы для тестирования новых целей. Убедитесь, что ваш BLAST морфолино против транскриптом, мы используем функцию блат на УСК данио генома браузера (genome.ucsc.edu). Конечно, если морфолино была подтверждена (строго) в литературе, то рекомендуется, что вы покупаете, что же последовательности.
2. Морфолино растворяется в стерильной DDH ₂ 0 до конечной концентрации 1 мМ и хранить при комнатной температуре. Не замораживать морфолино решений, а почему-то низкие температуры иногда может привести к их совокупности и выпадают в осадок. Morpholinos нечувствительны к протеаз и нуклеаз, так как пока вы добавляете воду является стерильной, то они должны быть совершенно безопасными при комнатной температуре.
3. Перед инъекционных, инкубировать морфолино при 65 ° С в течение 5 минут, чтобы обеспечить ее полностью не растворится, и дать остыть до комнатной температуры. НЕ кладите образца на льду. Держите морфолино при комнатной температуре до инъекции.
4. На титрование морфолино, мы обычно подготовке серийных разведений фондовом концентрации в DDH ₂ 0 уступить рабочие концентрации 1 мМ, 0,5 мм, 0,25 мм, и 0,125 мм. В зависимости от последовательности, используя 1,8 п инъекции объема, это составляет примерно 20ng, 10ng, 5ng и 2.5ng из морфолино на инъекцию. Это всего лишь отправной точкой, так как толерантность и эффективности каждого морфолино будет меняться и не может быть предсказано. Большинство morpholinos не будут допускаться гораздо выше 20 нг, но некоторые могут быть эффективны в дозах, значительно ниже 1 нг. Наш подход состоит в определении концентрации, при которой фенотип "плато". Другими словами, если определены фенотип не видел использованием 2,5 нг, но похоже использованием любого количества на уровне или выше 5 нг, мы выбрали бы 5 нг как порог суммы. Конечно, было бы полезно, чтобы следующий титровать от 2,5 нг и 5,0 нг, чтобы гарантировать, что вы работаете воспроизводимо за порогом, а не право "на границе".
5. Заполните прилагаемую иглу и калиброванного(См. выше) с самой низкой рабочей концентрации (в большинстве разбавленных) морфолино решение. Избегайте чрезмерного заполнения иглы, так как это просто отходы. Если вы заполните только 1 мкл, имеется достаточное решение для инъекций 500.
6. Использование одноразовой пипетки, трансфер оплодотворенной одноклеточных эмбрионов в желобов микроинъекции пластины. Удалите излишки воды, чтобы удостовериться, что эмбрионы падения на дно желоба инъекции. Они не должны плавать, а, скорее, придерживаются кровать агарозы.
7. Позиция инъекции тарелку так, чтобы микроманипулятора может спуститься иглы через хориона и в желток для инъекций. Чтобы разместить отдельных эмбрионов, манипулировать инъекции пластину так, что кончик инъекционной иглой толкает или тянет эмбрионов в правильное положение. Будьте осторожны, чтобы не сломать кончик иглы или повреждение эмбриона! Это требует некоторой практики, но, как правило, вы используете микроманипулятора просто двигаться инъекции иглу в эмбрион, а затем после инъекции, довольно быстро и чисто из. Эмбрионы были приведены в инъекции положение путем перемещения пластины с использованием свободной рукой (левой рукой, если вы придете со своей правой рукой). Для нового ученика, было бы полезно попрактиковаться в использовании раствор, содержащий 0,25% фенола красного, чтобы визуализировать вводят раствор. Уверенность также получили путем инъекции раствора, содержащего флуоресцентные микросферы с метками (Molecular Probes, F-8794), чтобы подтвердить, что решение вводили в зародыше, а не между хориона пространства. Однако, после нескольких раундов практике эти средства, как правило, больше не требуется. Это хорошая идея, чтобы время от времени вводить в воздух, просто чтобы убедиться, что игла не засорен, и что объем которой вводили представляется целесообразным.
8. Введенный эмбрионы переносятся обратно на 100 мм чашки Петри с системой водоснабжения и культивировали при 28.5C. После введения минимальной рабочей концентрации, оставшиеся решение может быть исключен и следующий по величине рабочей концентрации морфолино используется для заполнения иглы. Повторите эти действия для каждой концентрации морфолино. Хотя можно промыть иглу с использованием воды, при тестировании различных морфолино, мы предпочитаем менять иглы и калибровки. Не забудьте сохранить когорте uninjected эмбрионов для проверки конкретной партии эмбрионов был здоровым и нормальным.

Шаг 3. Сотрудничество инъекции morpholinos на индивидуальных доз порог

Целью титрования проведенного выше было определение пороговой дозы для каждого морфолино. В лучшем случае, по существу, 100% morphants появится определенный фенотип, если целевой ген играет важную функцию. Однако можно ожидать некоторого изменчивость из-за неправильной инъекции артефактов. С практикой, это не должно превышать 10%. Некоторые партии эмбрионов (в том числе uninjected управления) может не выжить хорошо, и в этом случае эксперимент, возможно, придется сбрасывать со счетов. Между тем, есть и биологической изменчивости, так как отдельные эмбрионов может быть более или менее терпимыми к нокдаун. Наконец, некоторые morpholinos может просто не быть достаточно эффективной для достижения надежной (проникающей) нокдаун. Если фенотип формируется в низкий процент эмбрионов, но воспроизводится, это может быть стоит попробовать различные морфолино. Цель этого следующий эксперимент, чтобы определить, совершенно новый фенотип наблюдается, когда оба гена целевых одновременно. Мы не просто ищем увеличение доли эмбрионов, которые morphant фенотип, а, скорее, для генерации различных фенотипа, что не видно на уровне или выше порогового уровня, при проверке одного из отдельных генов.

1. Приготовить смесь из сочетания morpholinos протестированных ранее, при пороговой концентрации каждого отдельного морфолино, создавший определенный фенотип. Например, если порог для каждого гена 5 нг, готовят рабочий раствор, который будет содержать 5 нг + 5 нг каждого (10 нг общего числа). Так как эмбрионы могут не переносить гораздо больше, чем 20 нг общего морфолино, важно, на основе предыдущих экспериментов, использовать минимальное количество каждого, достаточную для эффективной целевой каждого гена.
2. Управления должна включать в себя наборы эмбрионы вводят с каждым отдельным морфолино только в той же концентрации, которая была использована для комбинации. Объемы инъекционного раствора должна быть постоянной (например, 1,8 п). Большим преимуществом использования репортера штамм является то, что вы можете оценить фенотип (например кардиомиоцитов дифференциации) в любое время, и неоднократно. Если эмбрионы должны быть обследованы на экспрессию генов путем гибридизации на месте, стадии соответствием эмбрионов и управления могут быть установлены в разное время после инъекции. Для нашего эксперимента, мы будем оценивать выражения GFP в качестве суррогата кардиомиоцитов дифференциации, примерно в 24 HPF.

Шаг 4. Eоценка фенотипов

1. Введенный эмбрионы должны быть проверены, сразу после инъекции, и несколько раз в течение дня, чтобы удалить мертвые или умирающие эмбрионы, так как они могут поставить под угрозу жизнеспособность оставшихся morphants. Для оценки экспрессии гена-репортера, эмбрионы изучены с помощью рассекает микроскоп оснащен флуоресценции мощности. Мы используем микроскоп Nikon SMZ1500, с 1X или 1,6 объективных и диапазон увеличения от 0,75 до 11.25x. При использовании флуоресцентных фильтров, не забудьте открыть диафрагму полностью открытой настройки для максимального интенсивности света. Также убедитесь, что использовали правильный фильтр, в зависимости от гена-репортера (GFP, ППП и т.п.).
2. Эмбрионы, как правило, седативные использованием 1 / 20 разведения в водную систему 4mg/ml запас метансульфонат tricaine. Запасы хранятся замороженными при-20С. Кроме того, эмбрионы могут быть умерщвлены использовании 20x tricaine акций. Эмбрионы, как правило, пройти обследование, даже если они все еще находятся в хориона. Тем не менее, особенно если они будут сфотографированы, это хорошая идея, чтобы удалить chorions острыми щипцами. Эмбрионы могут быть просмотрены после размещения в депрессии слайдов в решении tricaine, или лучше обездвижить их фотографии помещены в небольшие капли 3% метилцеллюлозы.
3. Соблюдайте эмбриона фенотипов в те вводят в комбинации с morpholinos сравнению с одиночными morphants. Здесь мы ищем образец выражения GFP в изначальном трубки сердца. В этом GFP штамм репортер выражается исключительно в кардиомиоциты через cmlc2 промоутер, который позволяет детальный анализ сердечного спецификации и морфогенезе сердца трубки.

Представитель Результаты

В нашем эксперименте, как и gata5 gata6 одного morphants показать воспроизводимых сердечной фенотипы при введении с пороговыми уровнями, хотя существуют значительные биологической изменчивости ^3,4. Например, большинство из gata5 morphants генерировать бифидо сердца, с GFP выражения расположены в двух регионах. Это происходит потому, сердечной прародителей не могут мигрировать правильно соединить в средней линии во время формирования сердца трубки. Однако некоторые из gata5 morphants делать генерировать дефектные трубки сердце, и в небольшом количестве (5%) наблюдается значительное уменьшение количества клеток GFP +. Мы считаем, что это отражает биологическую изменчивость, но также может быть связано с тем, что morpholinos не эквивалентны "нулевой" мутации.

Кроме того, gata6 morphants все показать сердечной фенотип, но есть ряд фенотипов в том числе небольшого числа бифидо нагревается, и сердца, которые являются морфологические нарушения по сравнению с uninjected эмбрионов контроля. Эта изменчивость не является необычным для сердечной фенотип морфогенетических, так как сердце образование представляет собой динамический процесс, по крайней мере некоторые из сердца фенотип может быть связано косвенно из эмбриональных дефектов морфогенетических. Тем не менее, важно, диапазон пороков сердца морфогенетических для gata5 и gata6 morphants является последовательным и воспроизводимым, и по большей части эмбрионов позволит существенно GFP + кардиомиоцитов.

В резком контрасте с gata5 и gata6 одного morphants, эмбрионы обедненного обоих факторов показать полную потерю выражения GFP, в соответствии с убытком в кардиомиоциты. Таким образом, gata5 и gata6 у каждого есть без избыточности функций для сердечной морфогенеза, но два гена, функционально излишним требование поколение дифференцированных кардиомиоцитов. Наши предыдущие исследования показали также, потери ранней маркеры кардиомиоцитов, в том числе nkx2.5, предполагая, требование для кардиомиоцитов спецификации ^3.

Обсуждение

В эксперименте, описанном здесь, мы объединили два morpholinos, каждый из которых только генерировать различные диапазон фенотипов, и нашел совершенно иной фенотип, когда они были совместно вводят вместе. Конечно, нам нужно оправдание для этого эксперимента в первую очередь. Мы подозревали, что два гена могут компенсировать друг друга для более ранней функции, в данном случае сердечной спецификации. Это потому, что гены тесно связана (и способных связываться с той же последовательности ДНК) и выражаются в модели перекры...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аквариумы и разделители для разведения рыб	Водные среды
Рыболовные сети	Система водных сред
вода			60мг Instant Ocean” на литр dH2O
100мм чашки Петри	BD Biosciences	351029
Микропипетка иглоуловитель	Sutter Instrument Co.	P-97 Flaming/Brown
3,5" стеклянные капилляры	Drummond Scientific	3-000-203-G/X
Лезвие бритвы	Personna Medical Care	94-120-71
Микрошлифовальный станок	Narishige International	EG-4
Сетчатый окуляр микроскопа	Premiere	MF-02
Микрометр	WARD' s Natural Science	94 W 9910
Ultrapure agarose	Invitrogen	15510-027
Шпатель	Fisher Scientific	14-357Q
Весы	Mettler Toledo	AB54-S/FACT
Одноразовые весы	Fisher Scientific	2-202-B
Обычная микроволновая печь	GE Healthcare
Колба Эрленмейера	Corning	4980
Предметные стекла для микроскопа	Fisher	Scientific 12-552
Градуированный цилиндр	Fisher Scientific	08-572-6D
Автоматическая пипетка	BrandTech	2026333
70% раствор для промывки этанола	Tarr	801VWR
N2 бак	Tech Air
Микроинъектор	Гарвардский аппарат	PLI-100
Микроманипулятор	Micro Instruments	Ltd
Препарирующий микроскоп	Nikon Instruments	SMZ1500
Parafilm	American National Can	PM-992
Минеральное масло	Sigma-Aldrich	M5904
Kimwipes	Kimberly-Clark Корпорация	34155
gata5 сайт сращивания morpholino	Genetools, LLC		5'-TCTTAAGATTTTTTACCTATACTGGA-3'
gata5 ATG Blocker	Genetools, LLC		5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3'
gata6 Long Isoform ATG Blocker	Genetools, LLC		5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3'
Одноразовая пипетка Пастера	Fisher Scientific	13-678-20B
Трикаин метансульфонат	Argent Labs	MS-222
Метицеллюлоза	ICN Biomedicals	155495
Тепловой блок	Fisher Scientific	11-718-4
Острые щипцы	Dumont		Размер 55
Депрессия Микрослайды	VWR международный	48339-009