$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Генерация первичных маммосфер из клеточных линий рака молочной железы человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги под стерильным капюшоном.
- Приготовьте Маммосферную среду, содержащую DMEM/F12 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина, 100 Ед/мл стрептомицина. Готовую среду готовят непосредственно перед использованием, добавляя 20 нг/мл рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (EGF; Sigma), 10 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов человека (bFGF; R&D Systems) и 1x B27 Supplement.
- Аспиратуйте среду из колбы, содержащей адгезивные клетки MCF-7 или MDA-MB-231 (или линию клеток рака молочной железы по вашему выбору; 70-80% слияние), дважды промойте в 1x PBS и трипсинизируйте клетки.
- Центрифугировать клетки при 200 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Сцеживать надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в 1-5 мл маммосферных сред. Пипетируйте вверх и вниз и, при необходимости, используйте фильтр с фильтром фильтра-фильтра ячейки размером 40 мкм для получения суспензии одиночных клеток. Используйте гемоцитометр, чтобы убедиться, что образовалась одноклеточная суспензия (если нет, используйте иглу 25 G, чтобы шприцевать клеточную суспензию до 3 раз).
- При необходимости выделить CD44+CD24-клеточное субпопуляцию с помощью FACS с использованием моноклональных антител против CD24-фикоэритрина (ПЭ) и анти-CD44-флуоресцеина изотиоцианата (ФИТК)9. В качестве альтернативы можно изолировать такую популяцию с помощью системы сортировки магнитно-активированных клеток (MACS) с комбинированными микрогранулами анти-CD44 и анти-CD24-биотина в соответствии с инструкциями производителя. Провести положительный отбор с помощью LS-колонок, а отрицательный — с помощью LD-колонок и подтвердить фенотипы всех выделенных клеток методом проточной цитометрии.
- Рассчитайте количество жизнеспособных клеток на мл с помощью trypan blue.
заметка: Жизнеспособность клеток рассчитывается как количество жизнеспособных клеток, деленное на общее количество клеток в пределах сетки на гемоцитометре. Клетки, которые поглощают трипановый синий, считаются нежизнеспособными. Для точного определения доли жизнеспособных клеток используется следующая процедура.
- Приготовьте 0,4% раствор трипана синего в PBS. Добавьте 0,1 мл раствора трипана синего подвойа на 1 мл клеток. Зарядите гемоцитометр и рассмотрите сразу под микроскопом при малом увеличении. Подсчитайте общее количество ячеек и количество ячеек с окрашиванием в синий цвет. Жизнеспособные ячейки = [1.00 – (Количество синих ячеек ÷ Общее количество ячеек)] × 100.
- Чтобы рассчитать количество жизнеспособных клеток на мл культуры, воспользуйтесь приведенной ниже формулой. Не забудьте сделать поправку на коэффициент разбавления.
Количество жизнеспособных клеток × 104 × 1,1 = клеток/мл культуры
- Ресуспендировать заданное количество клеток в 2 мл полной маммосферной среды в каждой лунке 6-луночного планшета со сверхнизким адгезивным прилипанием. Плотность заделки семян в норме составляет 500-4 000 ячеек/см2 ячейки на лунку. Опционально использовать 24-луночные планшеты с низким прикреплением при засевании ячеек при одинаковой плотности в 0,5 мл среды.<бр/>
заметка: Мы рекомендуем оптимизацию густоты посева и времени культивирования для каждой интересующей клеточной линии.
- Инкубируйте 6-луночные планшеты с ультранизким уровнем прикрепления при 37 °C и 5%CO2 в течение 5-10 дней (в зависимости от клеточной линии и размера маммосферы), не нарушая планшеты, особенно во время фазы роста первых 5 дней.