Трансдукция для мечения опухолевых клеток PDX: введение лентивируса, экспрессирующего флуоресцентный маркер, в опухолевую клетку in vitro

Аннотация

Источник: Hanna, C., et al. Мечение ксенотрансплантатов, полученных от пациентов с раком молочной железы, с отслеживаемыми репортерами для исследований роста опухоли и метастазов. J. Vis. Exp. (2016).

В следующем видео описывается техника трансдукции для мечения (полученных от пациента ксенотрансплантатов) опухолевых клеток PDX, которая используется для введения лентивируса, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок, и репортеров люциферазы в опухолевую клетку in vitro.

Протокол

1. Трансдукция опухолевых клеток, полученных из PDX

1. Центрифуги диссоциировали опухолевые клетки в дозе 300 г х 5 мин и ресуспендировали в 2 мл маммосферных сред. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью исключения трипанового синего (Ресуспендируйте переваренные клетки в буфере для промывки объемом 5 мл и подсчитайте как жизнеспособные, так и нежизнеспособные клетки с помощью исключения трипанового синего. Кратко смешайте 50 μл клеток и 50 μл трипанового синего и подсчитайте трипановый синий без учета клеток с помощью гемоцитометра.
2. Приготовьте 10 мл маммосферной среды, содержащей 8 мкг/мл полибрена (2 мкл стокового полибрена на мл среды).
3. Определите объем, необходимый для 2 х 10⁵ жизнеспособных опухолевых клеток. Центрифугируйте ячейки при давлении 300 х г в течение 5 мин и ресуспендируйте гранулы в 2 мл полибреносодержащей среды. Планшет 2 x 10⁵ жизнеспособных опухолевых клеток в лунке в 6-луночном планшете для культуры тканей со сверхнизкой адгезией.
   заметка: Это оптимальное количество клеток, необходимое для трансдукции одним лентивирусным вектором.
   осторожность!Лентивирусные частицы и все расходные материалы, используемые с лентивирусными частицами, должны обрабатываться в соответствии с институциональными процедурами в отношении биологически опасных рекомбинантных ДНК.
   заметка: Лентивирусная трансдукция первичных клеток молочной железы сильно благоприятствует миоэпителиальным клеткам, что может привести к плохому мечению люминальных клеток и отбору субпопуляций опухолевых клеток во время мечения.
4. Инкубируйте вирус с 200 мЕд/мл нейраминидазы при 37 °C в течение 1 часа до трансдукции, чтобы увеличить связывание вирусных частиц с различными субпопуляциями первичных клеток и скорректировать это потенциальное смещение.
5. Добавляйте лентивирусные частицы при 10 MOI (2 x 10⁶ TU для 2 x 10⁵ жизнеспособных клеток), если PDX-диссоциированные клетки истощены клетками мыши Lin+ или обогащены клетками EpCam+. Добавляйте лентивирусные частицы при 30 MOI (6 x 10⁶ TU для 2 x 10⁵ жизнеспособных клеток) при использовании необогащенных PDX-диссоциированных клеток.
   заметка: Повышенный MOI обеспечивает эффективную трансдукцию даже в присутствии большого количества мусора и мертвых клеток в сырых экстрактах. Хорошо держите один из них с немечеными клетками, чтобы они служили контролем жизнеспособности и эффективности трансдукции.
6. Завихрите, чтобы смешать вирус с клетками. Инкубировать при 37 °C, 5%_CO2 в течение 96 часов. Добавьте 500 μл свежей маммосферной среды через 24 часа после трансфекции. Клетки не будут прикрепляться к пластинам, не будут аспирировать среды.

2. Оценка эффективности трансдукции и реимплантации меченых клеток у мышей с ослабленным иммунитетом

1. Контролируйте экспрессию отслеживаемого маркера (GFP) каждые 24 часа с помощью флуоресцентного микроскопа с 10-кратным увеличением.
   заметка: Экспрессия GFP может наблюдаться уже через 24 часа после заражения, но в большинстве PDX экспрессия GFP четко видна через 72 часа (Рисунок 1).
2. Оцените эффективность трансдукции, оценив процентное содержание GFP+ клеток в общей лунке.
   заметка: Поскольку культуры содержат опухолевые клетки, остаточные стромальные клетки и мертвые клетки различной степени, мыши-хозяину можно имплантировать лунки с 10% клеток GFP+.
3. Перенесите трансдуцированные клетки из 6-луночных планшетов в коническую пробирку объемом 15 мл. Добавьте в лунку 1 мл маммосферной среды, чтобы собрать все оставшиеся клетки. Выложите на лед.
4. Добавьте 10 мл HBSS/hepes к трансдуцированным клеткам и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин, 4 °C. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в 50 мкл экстракта базальной матрицы (BME) на льду.
   заметка: Аликвоты BME необходимо размораживать на льду за 1 - 2 часа до использования. BME затвердевает при комнатной температуре; Всегда держитесь на льду.
5. Загрузите клетки, встроенные в BME, в инсулиновый шприц объемом 0,5 мл, держите на льду и привезите в помещение для животных для реимплантации мышам NSG.

Результаты

Рисунок 1: Отслеживание эффективности трансдукции в диссоциированных клетках PDX. А) PDX-диссоциированные клетки, обогащенные эпителиальными клетками человека (истощение Lin+) через 24 часа после трансдукции лентивирусными частицами pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro. Б) PDX-диссоциированные клетки из отдельного эксперимента, без обогащения эпителиальными клетками, через 72 часа после трансдукции ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM/F12 (1:1)	Гиклон	SH30023.01
bFGF	BD Biosciences	No 354060 (Английский
ЭФР	BD Biosciences	354001
Гепарин	сигма	Н4784
В27	Gibco/Thermo Fisher	17504-44
Противогрибковые антибиотики	Гиклон	SV30010
Без HBSS Red Ca2+/Mg2+	Гиклон	SH30031.02
Хепес
Культрекс	Культрекс	3433-005-01	Экстракт подвальной матрицы (BME)
Шейкер 30 °C	Нью-Брансуик Сайентифик Ко. Инк	Шейкер инкубатора серии 25

) гг.