Совместное культивирование клеток РМЖ: культивирование клеток рака молочной железы с костными фрагментами для изучения пролиферации раковых клеток

Аннотация

Источник: Templeton, Z. S., et al. Методы культивирования эксплантов бедренной ткани человека для изучения колонизации метастатической ниши клетками рака молочной железы. J. Vis. Exp (2015).

Это видео описывает культивирование клеток рака молочной железы, прилегающих к эксплантам бедренной кости, для измерения пролиферации и колонизации раковых клеток в модельной системе эксплантов костной ткани человека.

Протокол

1. Совместное культивирование клеток рака молочной железы, прилегающих к костным фрагментам, для измерения пролиферации клеток молочной железы с помощью BLI

1. Перед началом эксперимента готовят суспензию, содержащую 2 x 10⁵ клеток рака молочной железы/50 мкл, и готовят пробки из костного воска для иммобилизации костных фрагментов в культуре. Разрежьте наконечник микропипетки P200 на 3 части и используйте узкий конец самой большой части «формочкой для печенья», чтобы разрезать небольшие (~35 мг) кусочки костного воска. Используйте широкий конец самого маленького кусочка, чтобы вытолкнуть пробки из костного воска в чашку Петри для хранения.
2. Поместите кусочек костного воска в положение «12 часов» каждой лунки и осторожно надавите указательным пальцем в стерильной перчатке.
3. Пипетка 50 мкл клеточной суспензии, содержащей 1 х 10⁵ клеток рака молочной железы в DMEM-10% FBS + Pen-Strep в центре каждой лунки 6-луночного планшета. (В качестве альтернативы, затравочные клетки в дисперсной схеме, если это необходимо.) Поместите планшет в инкубатор для тканевых культур при температуре 37 °C на 45 минут, чтобы способствовать прикреплению клеток.
4. Поместите 1 фрагмент кости на 1 кусок костного воска для каждой экспериментальной лунки и слегка надавите на него, чтобы закрепить. Проводите эксперименты в трех экземплярах таким образом, чтобы 3 костных фрагмента из данного образца THR были помещены в три верхние лунки, в то время как нижние три лунки содержали костный воск только в качестве контроля.
5. С помощью пипетки объемом 5 мл аккуратно и медленно подайте 5 мл DMEM-10% FBS в боковую ячейку каждой лунки, чтобы избежать смещения клеток молочной железы или фрагментов костей. Поместите планшет в инкубатор для тканевых культур при температуре 37 °C на 20-24 часа.
6. Для проведения биолюминесцентной визуализации (BLI) извлеките планшет из инкубатора и добавьте в каждую лунку субстрат люциферина (для достижения концентрации 300 мкг/мл). Немедленно визуализируйте пластину на платформе визуализации IVIS с использованием следующих параметров: f-ступень 1, малый биннинг, время экспозиции 1 сек, уровень D. Измерьте интенсивность сигнала каждой лунки, а также среднее излучение (фотоны/секунду/квадратный сантиметр/стерадиан).
7. Используйте программное обеспечение для визуализации для определения областей интереса (ROI) для количественной оценки среднего излучения для всех экспериментальных и контрольных скважин. Экспортируйте средние значения яркости на лист Excel для выполнения статистики и создания графиков.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Технологии Life	10569-010	Дополните все DMEM 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% Pen/Strep
Фетальная бычья сыворотка	Технологии Life	16000-044
Пенициллен стрептомицин	Технологии Life	15140-122
D-люциферин светлячок, калийная соль 5 г (30 мг/мл)	Технологии Life	Л-8220
6-луночный кластер клеточных культур, обработанный TC	Корнинг Инкорпорейтед	No 3516
Фридман-Пирсон Ронгер	Инструменты для точной науки	16021-14
Костный воск	Корпорация хирургических специальностей	903
Платформа визуализации IVIS 50	Калипер Медико-биологические науки/ПеркинЭлмер
Клетки рака молочной железы MCF-7	АТКС	ХТБ-22
MDA-MB-231 клетки рака молочной железы	АТКС	ХТБ-26

гг.