Органная кондиционированная среда: генерация среды из собранных клеток органов для исследований метастатического рака

Аннотация

Источник: Piaseczny, M. M., et al. Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Study Organ-Specific Influences on Metastatic Behavior при раке молочной железы. J. Vis. Exp. (2016).

В этом видео описывается метод создания органной кондиционированной среды, полученной из печени мыши. Эта модельная система может быть использована для идентификации и изучения растворимых факторов органного происхождения и их влияния на тропизм органов и метастатическое поведение раковых клеток.

Протокол

1. Генерация сред, обусловленных легкими и мозгом

1. В капюшоне для культуры стерильных тканей трижды переверните трубки PBS, содержащие легкие или мозг, чтобы удалить остаточную кровь из органов и аспирировать PBS, содержащую кровь. Повторяйте с помощью свежей холодной PBS до тех пор, пока раствор не станет прозрачным без признаков крови.
2. Поместите легкие и мозг в отдельные стеклянные чашки Петри диаметром 60 мм2. Используя два стерильных лезвия скальпеля, измельчите легкие или мозги, многократно разрезая вперед и назад, пока фрагменты ткани не станут примерно ~ 1 мм3 в размере.
3. Определите количество среды, необходимой для ресуспендирования фрагментов ткани, исходя из рассчитанной разницы весов.
   заметка: Легочная и мозговая ткани нормализуются по весу путем ресуспендирования в соотношении среда:ткань (об/масса) 4:1.
4. Ресуспендируйте фрагменты ткани в соответствующем объеме (определенном ранее на шаге 1.3) модифицированной среды Dulbecco Eagle's Medium (DMEM): F12 с добавлением 1x концентрированной добавки митогена и пенициллина (50 мкг/мл)/стрептомицина (50 мкг/мл).
5. Добавьте ресуспендированные фрагменты легочной или мозговой ткани в одну лунку 6-луночного планшета.
6. Инкубируйте фрагменты тканей в среде в течение 24 часов при 37 °C и 5% CO2. После инкубации соберите кондиционированную среду для каждой ткани и дополнительно разбавьте, добавив три эквивалентных объема свежей среды в коническую пробирку объемом 50 мл.
7. Центрифугируйте при давлении 1000 x g в разбавленной кондиционированной среде для каждого органа при 4 °C в течение 15 мин для удаления крупных остатков тканей. Соберите надосадочную жидкость и отфильтруйте через шприцевой фильтр 0,22 мкм.
8. Объедините кондиционированные среды из каждого органа (т.е. легкого с легким и мозга с мозгом) от нескольких мышей, чтобы учесть вариабельность от мыши к мыши. Кондиционированные среды следует применять и хранить при температуре -80 °C до использования.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1x Фосфатно-солевой буфер	ThermoFisher Scientific	10010-023	Сохраняйте стерильность
Стеклянные чашки Петри 60 мм2	Сигма-Олдрич	CLS7016560	Сохраняйте стерильность
DMEM:F12	Технологии Life	No 21331-020	Перед применением подогреть на водяной бане при температуре 37 °C, хранить в стерильном
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)	Технологии Life	15140-122	Сохраняйте стерильность
Конические тубы 50 мл	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Сохраняйте стерильность
Шприцевые фильтры 0,22 мкм	Сигма-Олдрич	Z359904	Сохраняйте стерильность
6-луночные планшеты для культивирования тканей	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Сохраняйте стерильность
Лезвия скальпеля	Научный центр Фишера	S95937A	Сохраняйте стерильность

состоянии