Инфляция индийских чернил: метод окрашивания для визуализации опухолевых узелков

Аннотация

Источник: Paschall, A. V. et al. Ортотопическая мышиная модель спонтанного метастазирования рака молочной железы. J. Vis. Exp. (2016).

Это видео описывает индийскую инфляцию чернил - метод окрашивания - для количественной оценки опухолевых узелков в легких мышей с опухолями. После окрашивания легкие фиксируются в растворе Фекете для наблюдения за опухолевыми узелками в легких.

Протокол

1. Валидация метастазов в легких с помощью индийских чернил для опухолевых легких

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить результаты визуализации живой опухоли люциферазы, выполните инфляцию индийскими чернилами легких мыши, несущих опухоль, для количественного определения опухолевых узелков. Клетки 4T1 также метастазируют в другие органы и ткани (Рисунок 1), и поэтому при необходимости следует провести гистологическое исследование этих органов для подтверждения метастазирования опухоли. В этом протоколе в качестве примера используются метастазы в легкие.

1. Держите мышей в их существующей домашней клетке для эвтаназии. При размещении с другими животными переместите мышей, которых не усыпляли, в другую клетку.
2. Снимите верхнюю часть фильтра клетки и установите на нее верхнюю часть фильтра CO2. Включите баллон со сжатым газом CO2 (100%), который подключен к верхней части фильтра CO2. Установите расход на уровне 2 л/мин и держите CO2 включенным не менее 10 минут. Если мыши все еще дышат по истечении 10 минут, оставьте CO2 включенным по крайней мере до 1 минуты после того, как мыши перестанут дышать. Выключите управление баллоном с CO2 и расходомер. Подождите еще 3 минуты и снимите верх фильтра.
3. Положите принесенную в жертву мышь на спину на полистирольной доске. Закрепите ножки, чтобы обеспечить беспрепятственный доступ к трахее. Опрыскайте мышей 70% этанолом.
4. С помощью ножниц разрежьте по средней линии средней части живота мыши через грудную клетку и вверх к слюнотворным железам. Понаблюдайте за трахеей. Используйте щипцы для удаления тканей, окружающих трахею, чтобы обнажить трахею.
5. Проденьте наконечник пипетки под трахею. Придерживая кончик одной рукой, аккуратно поднимите трахею вверх и в сторону от тела.
6. Поверните платформу, удерживая мышь, на 180°. С помощью туберкулинового шприца 1/2 CC 27 G 1/2 введите индийские чернила (10% индийских чернил и 0,1% гидроксида аммония) в легкие через трахею. Полностью накачайте легкие чернилами до тех пор, пока не будет ощущаться сильное сопротивление.
7. С помощью ножниц разрежьте трахею. С помощью щипцов удерживайте мышь, вставьте еще один набор щипцов под легкие и вытяните доли легких из мыши. Кратко промойте легкие в стакане с водой.
8. В вытяжном шкафу для химикатов перенесите легкие в стеклянный сцинтилляционный флакон, содержащий 3 мл раствора Фекете (50% этанола, 6% формальдегида и 3% ледяной уксусной кислоты). Закройте флакон крышкой, чтобы раствор не испарился.
   заметка: Ткани могут храниться в растворе Фекете неограниченное время.
9. Через несколько минут наблюдайте за опухолевыми узелками в виде белых точек на черных легких (рисунок 1). Белый опухолевый узел виден по глазам. Перенесите легкие в посуду в вытяжной шкаф и посчитайте количество белых пятен. Каждое белое пятно представляет собой один метастатический опухолевый узел.

Результаты

Рисунок 1. Визуализация опухолевых узелков легких с помощью инфляции индийских чернил. Легкое мыши-носителя опухоли было надуто индийскими чернилами и зафиксировано в растворе Фекете. Белые точки — это метастазы в легких.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аппликатор AutoClip 9 мм	Бектон Дикинсон Первичная медико-санитарная диагностика. Спаркс, Мэриленд	427630
Остроконечные ножницы для препарирования	рыбак	8940
Рассечение тонкозаостренных щипцов	рыбак	8875
70% этанол	Ultrapure-usa.com
1/2 CC 27 G 1/2 туберкулиновый шприц	Бектон Дикинсон и Ко. Нью-Джерси	305620 (Английский

)