Механическая диссоциация: метод получения жизнеспособных клеток из ткани

Аннотация

Источник: Garaud et al., Простой и быстрый протокол для неферментативно диссоциации свежих тканей человека для анализа инфильтрирующих лимфоцитов. J. vis. Exp. (2014).

Это видео описывает неферментативную диссоциацию свежей человеческой ткани для получения жизнеспособных клеток. Методика используется для качественного и количественного анализа CD45-положительных клеток (лимфоцитов/лейкоцитов), присутствующих в различных нормальных и злокачественных тканях человека.

Протокол

1. Получение гомогената тканей

1. Вскрытые резецированные ткани (злокачественные и нормальные ткани, удаленные из операционной) находятся в патологической лаборатории обученным персоналом для немедленного забора. Опухоль, NANT (взятые на максимально возможное расстояние от опухоли) и фрагменты нормальной ткани обычно обрабатываются в течение 1-3 часов после хирургического иссечения в лаборатории BSL2 с использованием стандартных процедур биобезопасности для тканей человека. Блок-схема протокола показана на рисунке 1.
2. Взвесьте все фрагменты ткани (нормальные, NANT и опухолевые) и измерьте длину, ширину и высоту (длина х ширина х высота). Это важный шаг для последующей нормализации клеточных субпопуляций, выделенной РНК и т.д.
   заметка: Диапазон размера образца составляет от 100 до 10 000^мм3 без жира, если это возможно.
3. Отпечатайте фрагмент опухоли на предметном стекле для окрашивания H&E, чтобы убедиться, что ткань действительно является частью опухоли.
   1. Для этого нужно надавить на предметное стекло стеклоподъемника микроскопа на фрагмент опухоли и слегка надавливать пальцами в течение нескольких секунд.
   2. Зафиксируйте предметное стекло изопропанолом на 2 минуты с последующей промывкой в воде. Закрасьте ткань в течение 30 секунд гематоксилином Майера.
   3. Промойте горку в шести ванночках воды. Окрашивать во Флоксин В 2% в течение 15 сек.
   4. Умойтесь в одной ванне с водой, затем в четырех ваннах с изопропанолом и закончите одной ванной с водой.
   5. Инкубировать в изопропаноле в течение 1 минуты и сцедить. Очистите в двух ваннах ксилол.
   6. Крепление с помощью монтажной среды на основе ксилола. Исследование на клеточность опухоли (рис. 2).
      заметка: В основном опухолевые клетки прилипают к отпечатавшемуся предметному стеклу – стромальные, лимфоидные или жировые клетки редко остаются, оставляя промежутки между опухолевыми клетками (рисунок 2).
4. Поместите фрагмент ткани в небольшую культуральную чашку, содержащую 1 мл химически определенной, не содержащей сыворотки крови гемопоэтической клеточной среды (далее именуемой средой) при комнатной температуре, и нарежьте его на мелкие кусочки (~1 - 2^мм2) с помощью стерильного скальпеля.
5. Перенесите все (фрагменты ткани + среда) в механический диссоциатор С трубки.
6. Промойте чашку Петри и скальпель 2 мл среды с помощью пастеровской пипетки и добавьте это в С-образную трубку (объем среды для диссоциации = 3 мл).
7. Используйте программу механического диссоциатора A.01 для С-трубок (самая щадящая программа) для гомогенизации фрагментов ткани в одноклеточную суспензию. Поместите трубку C в аппарат и запустите программу два раза подряд (один цикл = 25 сек).
   заметка: Эта процедура гомогенизации была разработана и валидирована для тканей молочной железы человека, другие опухоли или типы тканей могут нуждаться в использовании другой программы и должны быть сначала протестированы.
8. Извлеките С-образную пробирку из аппарата и сцедите гомогенат непосредственно в клеточный сетчатый фильтр 40 мкм, расположенный на пробирке объемом 50 мл. Используя ту же дозатор Пастера, что и в шаге 1.6, перенесите всю жидкость, оставшуюся в С-образной трубке, в сетчатый фильтр.
9. Переложите отфильтрованную жидкость в пробирку объемом 15 мл с помощью наконечника микропипетки объемом 1 мл. Временно сохраните сетчатый фильтр и его пробирку объемом 50 мл.
10. Промойте С-образную пробирку еще 3 мл среды и перенесите ее, снова используя ту же пипетку Пастера, что и в шаге 1.6, на клеточное ситечко, все еще находящееся на пробирке объемом 50 мл. Выдавите максимальное количество остаточной жидкости, попавшей в негомогенизированную ткань, в пробирку объемом 50 мл, осторожно перемещая ее вокруг ситечка с помощью чистой пастеровской пипетки или наконечника объемом 1 мл, который впоследствии выбрасывается, чтобы избежать загрязнения элюата.
11. Поместите клеточный фильтр вверх дном на исходную С-трубку и промойте 3 мл среды, чтобы негомогенизированная ткань опустилась обратно в С-трубку.
12. Повторная гомогенизация, как показано на шаге 1.7, для двух циклов программы A.01.
13. Влейте этот второй гомогенат через клеточный фильтр, расположенный на пробирке объемом 50 мл, снова промойте пробирку С средой объемом 3 мл (как в шаге 1.10) и перенесите пипеткой Пастера в клеточный фильтр, расположенный на пробирке объемом 50 мл, снова выдавливая максимальное количество жидкости из остаточной соединительной ткани, попавшей в клеточный фильтр
.
14. На этом этапе объем ~2,5 мл находится в пробирке 15 мл и ~9 мл в пробирке 50 мл.

2. Разделение надосадочной жидкости и клеток

1. Центрифугируйте гомогенаты в пробирках по 15 мл и 50 мл в течение 15 мин при 600 x g при комнатной температуре.
2. Сцедите SN из пробирки объемом 15 мл в чистую пробирку и временно храните при температуре 4 °C. Эта надосадочная жидкость = первичная опухоль, NANT или SN нормальной ткани (конечный объем 2,5 мл) затем осветляется и аликвотируется перед хранением при -80 °C для будущих анализов (см. ниже).
3. Выбросьте надосадочную жидкость из пробирки объемом 50 мл.
4. Аккуратно ресуспендируйте обе клеточные гранулы в итоговом объеме 1 мл среды. Кратко, сначала аккуратно разбейте клеточную гранулу в обеих пробирках (постукивая трубкой по твердой поверхности). Повторно суспендируйте гранулу с рассыпчатыми ячейками в 50 мл с 500 мкл среды и перенесите эту клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл для ресуспендирования второй гранулы. Повторите этот шаг один раз со второй 500 мкл среды для максимального восстановления клеток.
5. Перелейте 10 μл клеточной суспензии в небольшую пробирку, смешайте с 10 μл трипанового синего (разведение 1:1) и подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью гемоцитометра.
   заметка: На этом этапе фракция клеточной суспензии также может быть проанализирована с помощью проточной цитометрии для оценки размера клетки, зернистости и, при желании, ограниченного числа маркеров субпопуляции для более точной оценки относительного распределения клеток в гомогенате до проведения обширного анализа или эксперимента. Все анализы с помощью проточной цитометрии включают мечение CD45 для нормализации субпопуляций.
6. Гранулируйте клетки центрифугированием при 300 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Клетки опухоли, NANT или нормальной ткани теперь готовы к дальнейшей очистке или анализу. Эти дополнительные шаги лучше всего выполнять в тот же день, что и операция.
   заметка: Для проточного цитометрического анализа, но не для сортировки клеток, остаточные эритроциты следует лизировать после мечения антителами путем добавления 0,4 мл буфера для лизиса эритроцитов в клеточную гранулу, немедленно вортексировать в течение 1 сек и инкубировать минимум 10 мин при комнатной температуре (в защищенном от света) перед анализом.

3. Осветление надосадочной

жидкости

1. Центрифугируйте пробирки объемом 1,5 мл с тканевой SN при 15 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
2. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не прикасаясь к грануле и не тревожа ее. Переложите в чистую пробирку (или пробирки) в зависимости от количества и объема желаемых аликвот
.
3. Храните надосадочную жидкость при температуре -80 °C для дальнейшего использования.

Результаты

Рисунок 1: Блок-схема протокола.Показана наша методика обработки свежих тканей человека и некоторые аналитические подходы, которые впоследствии могут быть использованы для оценки лимфоцитов, инфильтрирующих ткани человека.

Рисунок 2: Окрашенное H&E изображение отпечатка ткани опухоли молочной желез...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Диссоциатор GentleMacs	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-093-235	BD Medimachine в некотором роде эквивалентен
Центрифуга 5810 R	Эппендорф		или другая стандартная настольная центрифуга
Центрифуга 5417 R	Эппендорф		или другой стандартной микроцентрифуги
Шкаф биобезопасности Esco класса II A2	ЭСКО в мире		или другой стандартный бленд BSL2
Инвертированный микроскоп	Фотоаппарат Nikon Eclipse TS100		или другой микроскоп, совместимый с гемацитометром
Палата Бюркера в Мариенфельде		Номер 640210	или другой стандартный гемацитометр
Проточный цитометр Navios	Бекман Коултер		или другой проточный цитометр (рекомендуется 8-10 цветов)
С-трубка GentleMacs	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-096-344	BD Medimachine использует Filcon
Чашка для клеточных культур	Сарштедт	72 710	или другая непирогенная пластиковая посуда
Одноразовый скальпель	Свон-Мортон	510	или стандартный одноразовый стерильный скальпель
Сетчатый фильтр BD 40 μм	Бектон Дикинсон	734-0002 (Английский	или другая непирогенная пластиковая посуда
BD Falcon Tube 50 мл	Бектон Дикинсон	No 352070 (Английский	или другая непирогенная пластиковая посуда
BD Falcon Tube 15 мл	Бектон Дикинсон	352097	или другая непирогенная пластиковая посуда
Туба BD FACS 5 мл	Бектон Дикинсон	352008	или другая непирогенная пластиковая посуда
Стерильная пипетка Пастера 5 мл	ВВР	612-1685	или другая непирогенная пластиковая посуда
Пробирка Microfuge 1,5 мл	Эппендорф	7805-00	или другая непирогенная пластиковая посуда
Икс-Виво 20	Лонза	БЭ04-448К	Рекомендуется среда без сыворотки
Фосфатно-солевой буфер	Лонза	БЭ17-516Ф	стандартный физиологический PBS
Трипан синий	ВВР	17942E	или другое жизненно важное пятно

) ) гг.