Анализ образования колоний мягких агаров: метод проверки влияния новых соединений на пролиферацию раковых клеток

Аннотация

Источник: Horibata A. et al., Использование анализа образования колонии мягкого агара для выявления ингибиторов опухолевой генности в клетках рака молочной железы. J. Vis. Exp. (2015).

Это видео описывает анализ образования колоний мягкого агара для проверки влияния ингибитора фермента PADI и BB-Cl-амидина на опухолевую генность рака молочной железы in vitro. Этот анализ также позволяет количественно оценить потенциал трансформации клеток в контексте генетических возмущений.

Протокол

1. Получение 3% 2-гидроксиэтилагарозы

1. В чистую сухую стеклянную бутылку объемом 100 мл добавьте 0,9 г 2-гидроксиэтилагарозы (Agarose VII) и 30 мл дистиллированной воды.
2. Разогрейте смесь в микроволновой печи в течение 15 секунд и аккуратно перемешайте. Повторите этот шаг еще не менее трех раз, пока агарозный порошок полностью не растворится.
3. Автоклавируйте флакон, содержащий раствор, в течение 15 мин.
4. Перед дальнейшим использованием дайте агарозному раствору остыть до RT. Храните решение в RT.

2. Подготовка нижнего слоя: 0,6% агарозный гель

1. Предварительно нагрейте несколько пипеток объемом 5 мл и 10 мл в инкубаторе при температуре 37 °C, чтобы предотвратить затвердевание агарозы в пипетке при работе.
2. Частично ослабьте крышку бутылки и разогрейте в микроволновой печи готовый 3% раствор 2-гидроксиэтилагарозы в течение 15 сек. Затем аккуратно взбейте раствор и разогрейте в микроволновой печи еще 15 секунд<бр/> осторожность: Будьте осторожны при взмешивании раствора агарозы, потому что при контакте с воздухом раствор поднимается вверх и может разлиться.
3. Если в бутылке есть остатки твердого геля, поставьте в микроволновую печь еще на несколько секунд.
4. Держите флакон с раствором агарозы на водяной бане при температуре 45 °C во время следующих действий, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание раствора агарозы.
5. Подогрейте MCF10DCIS среде на водяной бане при температуре 37 °C.<бр/> заметка: MCF10DCIS среда состоит из DMEM/F12, 5% лошадиной сыворотки, 5% пенициллина стрептомицина.
6. Перелейте 3 мл 3% раствора агарозы с помощью предварительно подогретых пипеток в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл.
7. Сразу же добавьте 12 мл теплого MCF10DCIS среды и аккуратно переверните коническую трубку, чтобы смешать агарозу со средой. Старайтесь не образовывать пузырей, так как это будет мешать подсчету колонии в дальнейшем.
8. Аккуратно добавьте по 2 мл этой смеси в каждую лунку 6-луночного планшета для культивирования, не образуя пузырьков воздуха.
9. Инкубируйте 6-луночный планшет горизонтально на плоской поверхности при температуре 4 °C в течение 1 часа, чтобы смесь затвердела.
10. После того как смесь застынет, поместите пластину в инкубатор с температурой 37 °C на 30 минут. Теперь нижний слой готов к использованию.

3. Подготовка клеточного слоя: 0,3% агарозный гель

1. Трипсинизируйте MCF10DCIS клетки и разбавьте их до клеточной концентрации 4 x 10⁴ /мл.
2. Возьмите 2 мл 3% агарозы с помощью предварительно подогретых пипеток и переложите в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл.
3. Сразу же добавьте в коническую трубку 8 мл MCF10DCIS среды и аккуратно переверните, чтобы перемешать агарозу с средой. Избегайте образования пузырей.
4. Возьмите 2 мл MCF10DCIS клеток (4 x 10⁴ /мл) и обработайте BB-CLA (0 μМ (ДМСО) или 1 μМ).
5. В разведении 1:1 смешайте клетки с 0,6% агарозой.
6. Возьмите 1 мл клеточно-агарозной смеси и аккуратно добавьте на нижний слой 6-луночного планшета для культуры (2 x 10⁴ клеток/мл).
7. Поместите 6-луночный планшет для культивирования горизонтально на плоскую поверхность при температуре 4 °C не менее чем на 15 минут, чтобы дать верхнему слою застыть.
8. После того как смесь застынет, поместите пластину в инкубатор с температурой 37 °C на неделю перед добавлением слоя кормления.

4. Подготовка питающего слоя: 0,3% агарозный гель

1. Разогрейте в микроволновой печи готовый 3% раствор 2-гидроксиэтилагарозы в течение 15 секунд, аккуратно взболтайте раствор и разогрейте в микроволновой печи еще 15 секунд.
2. Уравновесьте флакон с агарозным раствором на водяной бане при температуре 45 °C.
3. Подогрейте MCF10DCIS среду на водяной бане при температуре 37 °C.
4. Смешайте 1 мл 3% раствора агарозы с 9 мл теплой MCF10DCIS среды в коническую трубку объемом 50 мл и аккуратно переверните, чтобы перемешать агарозу со средой. Избегайте образования пузырьков воздуха.
5. Обработайте смесь BB-CLA (0 мкМ (ДМСО) или 1 мкМ).
6. Аккуратно добавьте по 1 мл этой смеси (не образуя пузырьков) в каждую лунку 6-луночной культуральной пластины, содержащей дно и мягкие слои.
7. Поместите 6-луночный планшет для культивирования горизонтально на плоскую поверхность при температуре 4 °C не менее чем на 15 минут, чтобы смесь затвердела.
8. После того как слой питателя застынет, поместите пластину в инкубатор с температурой 37 °C.
9. Повторяйте эту процедуру кормления еженедельно, нанося 1 мл 0,3% раствора агарозы/среды/обработки на существующий питательный слой для пополнения клеток новыми средами до тех пор, пока не будет наблюдаться образование колоний.
   заметка: Агар в мягких и питающих слоях очень мягкий, поэтому добавленные питательные вещества из питающего слоя будут легко диффундировать в клеточный слой и достигать клеток.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Цейсс Аксиопот	Микроскопия Carl Zeiss	1021859251
Инвертированный микроскоп	Олимп	СКХ41
ДМЭМ/Ф-12	Лонза БиоУиттакер	12-719Ф
HyClone Донорская сыворотка для лошадей	Научный центр Фишера	SH30074.03
Пенициллин стрептомицин	Технологии Life	15140-122
2-Гидроксиэтилагароза: тип VII, низкая температура гелеобразования	Сигма-Олдрич	39346-81-1 (Английский)