Инъекция в хвостовую вену: метод введения раковых клеток для метастатических исследований на мышиной модели

Аннотация

Источник: Warren et al., Комбинированное использование анализов метастазов в хвостовых венах и визуализации in vivo в реальном времени для количественной оценки метастатической колонизации рака молочной железы и нагрузки в легких. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео описывает технику введения меченых раковых клеток с помощью инъекции хвостовой вены в мышиную модель. Кроме того, мы отслеживаем рак молочной железы, образование и рост метастазов с помощью визуализации живых животных in vivo в режиме реального времени.

Протокол

1. Инъекция в хвостовую вену меченых раковых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1.2.4 был оптимизирован для роста клеток 4T1 у сингенных мышей BALB/c. Если используются другие линии раковых клеток и линии мышей, сначала следует оптимизировать количество вводимых клеток и длину анализа.

1. Разверните клеточные линии 4T1, полученные на шаге 2, на двух чашках по 15 см в полной питательной среде, чтобы избыток клеток был доступен в день инъекции.
2. Подготавливают клетки к введению в хвостовую вену следующим образом:
   1. Отсадите среду и промойте клеточные пластины с помощью 1x PBS.
   2. Трипсинизируйте клетки 5 мл трипсина на 15 см пластину в течение 2-5 минут (клетки должны свободно смыть со дна лунки). Перенесите все клетки в коническую трубку. Промойте оставшиеся клетки из чашки для культивирования тканей достаточным количеством полной питательной среды, чтобы погасить трипсин, и добавьте промывку в ту же коническую трубку.
   3. Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек, чтобы определить общее количество ячеек.
   4. Центрифугируйте клетки при давлении 122 x g в течение 3 минут, аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 1x PBS в желаемой концентрации. Здесь 2,5 x 10⁴ клетки вводятся каждой мыши в 100 мкл PBS, таким образом, ресуспендированные клетки в концентрации 2,5 x 10⁵ клеток/мл. Держите клеточные суспензии на льду до инъекции.
      Примечание: важно ограничить время между трипсинизацией клеток и инъекцией в хвостовую вену примерно до 1 часа.
3. Введите мышам клетки 4T1 из шага 1.2.5 через боковую хвостовую вену следующим образом:
   1. Работая в вытяжке в помещении для животных, осторожно, но тщательно перемешивайте клетки, переворачивая трубку или используя шприц объемом 1 мл, чтобы обеспечить их равномерную ресуспендию. Перед загрузкой шприца всегда следите за тем, чтобы ячейки были подвешены.
   2. Загрузите шприц объемом 1 мл люэровского замка с клеточной суспензией и изгоните лишние пузырьки воздуха. Поместите иглу 1/2 дюйма 30-го калибра на шприц скосом вверх и удалите пузырьки воздуха.
   3. Аккуратно поместите мышь в удерживатель от грызунов.
   4. Боковые хвостовые венки должны быть видны и расширены. Если нет, аккуратно ущипните основание хвоста и опустите хвост в теплую воду из-под крана, чтобы расширить вены.
      заметка: Расширение вен также может быть достигнуто путем помещения клетки мыши под нагревательную лампу и/или поверх грелки.
   5. Используйте спиртовую салфетку для очистки хвоста. Введите иглу в хвостовую вену скошенной стороной вверх и введите 100 μл клеточной суспензии.
      заметка: Если игла правильно введена в вену, она должна легко скользить немного вперед и назад, при нажатии на поршень не должно быть сопротивления. Успешные инъекции также должны привести к «приливу», при котором синий цвет вены становится белым в течение нескольких секунд после инъекции.
4. Медленно извлеките иглу и с помощью стерильной марли надавите на место инъекции, чтобы остановить кровотечение.
5. Верните мышь в клетку и наблюдайте за ней в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное восстановление. Мышей следует проверять на наличие признаков боли или недомогания 3 раза в неделю.
6. Наблюдайте за образованием и ростом метастазов у мышей в течение 3-6 недель (в зависимости от клеточной линии и штамма мыши) с помощью устройства визуализации живых животных in vivo (см. шаги 1.5 и 1.6).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2,5% трипсин	Gibco	15090-046	Трипсин для культивирования тканей
Спиртовые салфетки			Для стеролизации места инъекции перед вращением хвостовых вен
Мыши BALB/C (самки, 6 недель)	Таконик	БАЛБ-Ф	Для метастатической колонизации хвостовой вены и анализов нагрузки
Дульбекко&39; s фосфатный буферный раствор	Химедиа	ТС1006
Эдта	ВВР	97061-406	Используется для разведения трипсина для культуры тканей
FBS 100% американского происхождения	ВВР	97068-085	Компонент готовых питательных сред
L-глютамин	Gibco	No 25030-081	Компонент готовых питательных сред
Клетки рака молочной железы мыши, 4T1	Институт рака Карманос	Аслаксон, С.Д. и др.,1992	Метастатическая клеточная линия молочной железы мыши
Пенициллин стрептомицин	Gibco	15140-122	Компонент готовых питательных сред