Методическая статья

Иммунофлуоресцентный анализ КТК: методика характеристики циркулирующих опухолевых клеток

30 апреля 2023 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Garcia, J., et al. Полуавтоматическая характеристика PD-L1 и подсчет циркулирующих опухолевых клеток у пациентов с немелкоклеточным раком легкого методом иммунофлуоресценции.J. Vis. Exp.(2019)

Это видео описывает иммунофлуоресцентный анализ циркулирующих опухолевых клеток (CTC), метод характеристики биомаркеров на циркулирующих опухолевых клетках в образцах пациентов с немелкоклеточным раком легких. Этот анализ может быть использован для мониторинга динамических изменений опухоли и иммунного ответа, которые могут отражать реакцию на химиотерапию, лучевую терапию и возможные методы иммунотерапии.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Иммунофлуоресцентное окрашивание

  1. Перечислите на камерном предметном стекле с сеткой гемоцитометрического типа количество клеток на мл. Разбавить обогащенный образец 0,2% раствором, препятствующим связыванию (Таблица материалов) до концентрации, достигающей 100 000 клеток/100 мкл на цитоспин.
  2. Смочите контур камеры образца с помощью ваты (Таблица материалов) 50 мкл 0,2% раствора против связывания. Поместите предметное стекло из полилизина в камеру для образцов и закройте.
  3. Нанесите на наконечник 0,2% раствор против связывания, пипетируя вверх и вниз 3 раза. Повторно суспендируйте обогащенный образец и перенесите клеточный раствор в камеру для образца. Центрифуга со специальной центрифугой (Table of Materials) при 400 об/мин в течение 4 мин (низкое ускорение).
  4. Поместите силиконовый изолятор вокруг области отложения. Дайте стеколе высохнуть под шкафом микробиологической безопасности в течение 2 минут.
  5. Приготовьте фиксирующий раствор, разбавив 1 мл 16% параформальдегида (PFA) с 3 мл стерильного PBS. Добавьте 100 μл фиксирующего раствора (4% PFA) на образец и инкубируйте при RT в течение 10 минут. Удалите фиксирующий раствор и выполните три промывки 200 μл PBS и инкубируйте при RT каждое по 2 мин.<бр/> ВНИМАНИЕ: Используйте PFA под шкафом химической безопасности для предотвращения вдыхания.
  6. Приготовьте питательный раствор путем разбавления фетальной бычьей сыворотки (FBS) в 5%, реагента, блокирующего рецептор Fc (FcR), в 5% и альбумина бычьей сыворотки (BSA) в дозе 1% в стерильном PBS (Таблица материалов). Добавьте 100 μL просачивающего раствора на каждый образец и инкубируйте в течение 30 мин при RT. Удалите насыщенный раствор.
  7. Добавьте 100 мкл раствора антитела на каждый образец (антитело CD45 1/20; Антитела PanCK 1/500; антитело PD-L1 1/200; Qsp насыщенный раствор 100 μл) (Таблица материалов). Поместите предметное стекло из полилизина в чашку Петри размером 100 мм x 15 мм. Смочите впитывающую бумагу 2 мл стерильной воды и закройте чашку Петри крышкой. Поставить на ночь при температуре 4 °C и беречь от света.
  8. Удалите смесь антител и выполните 3 промывки 200 мкл PBS, инкубируя каждую промывку в течение 2 минут. Дайте образцу высохнуть в течение 5 минут и защитите его от света. Поместите 10 μL монтажного раствора (Таблица материалов) в область нанесения и накройте покровным стеклом микроскопа, не образуя пузырей. Заклейте покровное стекло лаком для ногтей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Pluronic F-68 10% Gibco 24040-032Раствор против связывания. Условия хранения: Комнатная температура
EZ Цитоворонки ТермоФишерA78710003Образец камеры с ватой. Условия хранения: Комнатная температура
Центрифуга Шандон Цитопсин4ТермоФишер A78300003Специальная центрифуга. Условия хранения: Комнатная температура
Параформальдегид 16%ТермоФишер 11490570Фиксирующий раствор. Условия хранения: +4°C
Фосфатно-солевой буферный ультрачистый сорт 1X – 1л1-я базовая лабораторияБУФ-2040-1С1ЛУсловия хранения: Комнатная температура
Агент блокировки FcR Милтеньи БиотекТел.: 130-059-901Условия хранения: +4°C
Моноклональное антитело PD-L1 (клон 29E2A3) - ФикоэритринБиолегенда BLE329706 Условия хранения: +4°C
Моноклональное антитело PanCK (клон AE1/AE3) Alexa Fluor 488ТермоФишер53-9003-80 Условия хранения: +4°C
Моноклональное антитело к CD45 (клон HI30) Alexa Fluor 647Биолегенда BLE304020Условия хранения: +4°C
Флюоромон сигма Ф4680Монтажное решение. Условия хранения: Комнатная температура
чашка ПетриДатчерNo 632180Условия хранения: Комнатная температура
Фосфатно-солевой буфер (PBS)ОзимБЭ17-512ФУсловия хранения: +4°C
Полилизиновые слайды ТермоФишерJ2800AMNZУсловия хранения: Комнатная температура
Силиконовый изолятор Grace bio-Labs 664270 (АнглийскийУсловия хранения: Комнатная температура
Стерильная деионизированная вода – 100 мл1-я базовая лаборатория CUS-4100-100мл Условия хранения: Комнатная температура
Фетальная сыворотка теленка (FCS)Gibco10270-106Условия хранения: +4°C
)

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PD L1PBS

Похожие статьи