Агарозное раздувание всего легкого: метод подготовки легких к визуализации ex vivo в реальном времени

Аннотация

Источник: Van den Bijgaart R.J.E. et al., Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment, J. Vis. Exp. (2016)

Это видео описывает метод подготовки легких к визуализации ex vivo в реальном времени для изучения взаимодействий между раковыми клетками и стромальными клетками с использованием агарозы для надувания. В протоколе образца описана процедура надувания агарозы до наблюдения за живыми клеточными взаимодействиями.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка легких к визуализации ex vivo в реальном времени

ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь работать как можно более стерильно и осторожно, чтобы избежать ненужных проблем с иммунными клетками в легких.

1. Введите мышке внутрибрюшинную систему (в/в) смертельную передозировку анестетика, разрешенного протоколом для животных, утвержденным IACUC, например, 1 мл 2,5% авертина. Подождите, пока мышь перестанет дышать и полностью перестанет реагировать на вредные раздражители (защемление задней лапой).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать вывиха шейки матки и эвтаназии углекислым газом, так как это может пагубно повлиять на жизнеспособность клеток легких.
2. Обездвижите мышь на доске для вскрытия и простерилизуйте мышь с помощью 70% этанола.
3. С помощью хирургических ножниц сначала сделайте поперечный надрез через кожу, а затем аналогичный разрез через брюшину. Держите доску для вскрытия в вертикальном положении и разрежьте нисходящую аорту, чтобы кровь стекала вниз в брюшную полость, а не в грудную полость.
4. Отрежьте небольшое отверстие в диафрагме, чтобы выпустить вакуум. Разрежьте вдоль 10-го и 12-го ребра, чтобы иссечь диафрагму и получить визуальный доступ к легким.
5. Хирургическими ножницами разрежьте кожу до трахеи над грудной клеткой, но оставьте грудную клетку нетронутой. Отделите кожу от грудной клетки. Обнажите трахею, удалив окружающую соединительную ткань, стараясь не повредить саму трахею (рисунок 1A).
6. Отрежьте небольшое отверстие диаметром около 1 мм в открытой трахее параллельно хрящевым кольцам, как можно ближе к гортани (рисунок 1B). Будьте осторожны, чтобы не разрезать трахею полностью.
7. Возьмите иглу 20 G и осторожно введите иглу на 4-5 мм в трахею без какого-либо противодействия. Конец иглы должен быть виден через трахею (рисунок 1В). Используйте щипцы для стабилизации иглы в трахее. В качестве альтернативы вокруг трахеи может быть наложен шов, чтобы удержать иглу на месте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При слишком глубоком введении киль может быть травмирован или может быть надута только одна сторона легких.
8. Наполните шприц 400 μл 37 °C 2% низкоплавкой агарозы (взятой непосредственно из ванны с постоянной температурой). Убедитесь, что доска для вскрытия стоит и медленно закапывайте теплую агарозу через иглу в легкие, используйте ~400 мкл для надувания легких.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за тем, как надуваются легкие внутри грудной клетки. Не надувайте легкое слишком сильно, так как оно может разорваться.
9. Как только легкие надутся, заполнив ~2/3 грудной клетки, отсоедините шприц и держите иглу внутри трахеи, чтобы предотвратить утечку агарозы.
10. Налейте примерно 50 мл PBS 20 °C на надутые легкие, чтобы агароза внутри легких застыла и затвердела. Медленно извлеките иглу и закройте трахею щипцами, чтобы предотвратить вытекание незатвердевшей агарозы.
11. Обнажить легкие путем выполнения стернотомии и впоследствии иссечь легкие. Для иссечения легких держитесь за трахею, одновременно разрезая трахею полностью. Аккуратно потяните трахею вверх, отрежьте соединительную ткань и пищевод, одновременно вытягивая легкие из грудной полости до тех пор, пока легкие не отделятся от мыши (рисунок 1E).
12. Погрузите легкие в теплую жидкость RPMI-1640, чтобы смыть излишки крови, и аккуратно отделите доли с помощью ножниц и щипцов, чтобы разрезать главный ствол бронхов долей в районе ворот (Рисунок 1F).
13. Поместите лепестки плоской поверхностью вниз, чтобы максимизировать визуализирующую поверхность, в лунку 24-луночного визуализирующего планшета (Рисунок 1G). Добавьте 100 мкл 37 °C RPMI-1640 поверх лепестков. Поместите несколько 15-миллиметровых предметных стекол круглой крышки микроскопа поверх лепестков, чтобы предотвратить его всплытие.
14. Налейте теплый PBS в окружающие лунки, чтобы предотвратить испарение фильтрующего материала RPMI-1640. Вставьте 24-луночный планшет в уравновешенную климатическую камеру и поддерживайте температуру воздуха в долях легких на уровне 37 °C и 5%_CO2. Установите климатическую камеру на предметный столик конфокального микроскопа.
    Примечание: Можно также рассмотреть другие газовые смеси (например, 5% O₂, 5% CO₂ в N₂ для изучения поведения клеток в условиях гипоксии/понижения содержания кислорода).

Результаты

Рисунок 1. Протокол подготовки легких к визуализации в реальном времени.(А) Обнажение трахеи после подготовки мыши. (В) Небольшой кусочек, сделанный в открытой трахее параллельно хрящевым кольцам. (В) Игла 20 G вводится на 4-5 мм в трахею. (D) Закапывание в легкие 400 μл 2% низкоплавкой агарозы. (E

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
анестезирующий	NA	NA	Анестезия, одобренная IACUC, используется для анестезии и/или эвтаназии
PBS, USP стерильный	Амреско ИНК	К813-500МЛ	Ультрачистый сорт для внутривенного введения
1X PBS	Центр культивирования клеток UCSF	NA
Платформа из пенополистирола	NA	NA	Будет использоваться как доска для вскрытия
Тонкие ножницы острые	Инструменты для точной науки	14060-11
20 G x 1 игла, короткая фаска	БД	305178
щипцы	Хирургический магазин Roboz	РС-5135
Шприц объемом 1 мл без иглы	БД	309659
Агароза с низкой температурой плавления	Лонза	50111	Для приготовления 10 мл раствора взвесьте 0,2 г агарозы, добавьте в 10 мл 1 х PBS, и нагрейте до полного растворения. Агароза затвердевает при комнатной температуре, поэтому выдерживайте на водяной бане при температуре 37 °C до тех пор, пока не будет использована для надувания.
RPMI-1640 среда без фенола красного	Технологии Life	11835-030
24-луночная визуализирующая пластина	Наука в области энергетики и кашмира	ЭК-42892
Стекольные стекла, 15 мм	Научный центр Фишера	Тел.: 22-031-144
Цифровой контроллер CO2 и температуры	Околаб	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
Климатическая камера	Околаб	NA	http://www.oko-lab.com
Конфокальный микроскоп с вращающимся диском Cell Observer	Цейсс	NA
воздух	UCSF	NA
кислород	UCSF	NA
двуокись углерода	UCSF	NA