1. Пассирование и культивирование клеток TUM622 в 2D-культурах
- Теплая 3D питательная среда и реагенты для диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) для клеток TUM622 при 37 °C.
- Пассаж клеток TUM622 при 80% слиянии в 2D-колбах. Обычно это происходит через 1 неделю после пассирования.
- Выбросьте старый носитель из колбы T75 и промойте один раз 6 мл буфера HEPES. Избегайте пипетирования непосредственно на клетки.
- Аспирируйте буфер HEPES. Добавьте 4 мл трипсина/ЭДТА (0,25 мг/мл, см. Таблицу материалов) для быстрого полоскания и выбросьте трипсин/ЭДТА.
- Добавьте 2 мл трипсина/ЭДТА и инкубируйте при 37 °C в течение 5 мин. Выньте колбы из инкубатора и постучите по колбам, чтобы ослабить ячейки без образования пузырьков воздуха, и верните колбы в инкубатор еще на 5 мин.<бр/>
заметка: Длительное воздействие трипсина необратимо повреждает клетки и изменяет их фенотип, поэтому рекомендуется ограничить время, в течение которого клетки подвергаются воздействию трипсина.
- Подтвердите отделение и диссоциацию клеток под световым микроскопом (4x или 10x). Добавьте 4 мл нейтрализационного буфера (TNS-буфера) (см. информацию о субкультуральных реагентах в Таблице материалов), а затем 10 мл 3D-питательной среды (см. Таблицу материалов).
Осторожно проводите - пипеткой вверх и вниз для дальнейшей диссоциации клеток с помощью пипетки объемом 10 мл. Перенесите суспензию через клеточное сетчатое фильтр 40 μм в коническую пробирку объемом 50 мл.
- Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
- Затравка 0,8 х 106 клеток/колба Т75 в 20 мл 3D питательной среды (см. Таблицу материалов).
- Подкармливайте клетки через день, заменяя половину отработанной среды свежей средой.
2. Покрытие клеток TUM622 во внеклеточном матриксе для 3D-культивирования
- За день до эксперимента разморозьте флаконы матрицы базальной мембраны в холодильнике при температуре 4 °C на ночь. Охладите пластиковые пипетки (2 мл) и наконечники при температуре -20 °C на ночь.
заметка: Не все партии матрицы базальной мембраны обладают одинаковой способностью поддерживать 3D-рост клеток TUM622. Таким образом, необходимо получить и протестировать несколько партий матрицы базальной мембраны, чтобы определить те, которые поддерживают устойчивое образование ацинусов. Обычно для этого требуется более высокая концентрация белка (16-18 мг/мл) в матриксе.
- В день эксперимента согрейте 3D питательную среду, буфер HEPES, трипсин/ЭДТА и буфер для нейтрализации трипсина (TNS) на водяной бане при температуре 37 °C. Непосредственно перед закладкой культуры достаньте из холодильника размороженную матрицу базальной мембраны и поставьте флакон на лед.
- Охлаждайте планшеты для культивирования тканей на металлической платформе-холодильнике, помещенном на лед. Поместите пробирки центрифуги на металлическую решетку для охлаждения на льду.
- Используя ячейки TUM622, полученные на шаге 1.7, рассчитайте желаемое количество ячеек, необходимых для нанесения покрытия. Как правило, на одну лунку 24-луночного планшета требуется 15 000-30 0000 ячеек. Более низкая плотность больше подходит для визуализации и количественного анализа, в то время как более высокая плотность предпочтительна при сборе клеток для экстракции РНК или вестерн-блоттинга.
- Перенесите суспензию ячеек в охлаждаемую центрифужную пробирку (каждая пробирка содержит ячейки для тройного покрытия) и вращайте при давлении 300 x g в центрифуге с подвесным ведром при 4 °C в течение 5 минут.
- Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость с помощью аспирационной пипетки, прикрепленной к нефильтрованному наконечнику (20 мкл), оставляя в пробирке примерно 100 мкл среды (используйте маркировку на пробирке в качестве ориентира).
- Осторожно постучите по боковой стороне трубки, чтобы выбить и диссоциировать гранулу, прежде чем вернуть ее на решетку для охлаждения.
- С помощью предварительно охлажденных пипеток объемом 2 мл аккуратно перемешайте матрицу, несколько раз пипетируя вверх и вниз, сохраняя при этом контакт флакона со льдом. Пипетку следует проводить с равномерной и умеренной скоростью, чтобы во время этой процедуры в матрицу не вводились пузырьки.
- Перенесите соответствующий объем матрицы в каждую центрифужную пробирку. Для нанесения тройных покрытий в 24-луночный планшет добавьте 1,1 мл матрицы базальной мембраны в каждую пробирку.
- Используя предварительно охлажденные наконечники, пипетируйте матрицу в каждой пробирке вверх и вниз около 10 раз, чтобы получить однородную клеточную суспензию.
- Перенесите 310 μL клеточной/матричной суспензии в каждую лунку предварительно охлажденного 24-луночного планшета. Пипетка размещается под углом 90° к поверхности пластины, а к центру лунки добавляется суспензия. Суспензия должна распространяться и покрывать весь колодец без необходимости наклона пластины.
- Чтобы облегчить последующий иммунофлуоресцентный анализ, поместите клеточное/матричное суспензию параллельно в 2-луночные предметные стекла. Перенесите 100 мкл клеточной/матричной суспензии в центр лунки 2-луночного камерного предметного стекла (см. Таблицу материалов). Это позволяет матрице образовывать куполообразную структуру с гораздо меньшим объемом.
- Верните планшет и камеру, вставьте обратно в инкубатор для культуры тканей и инкубируйте в течение 30 минут, чтобы матрица затвердела. Рассмотрите пластину/предметное стекло под световым микроскопом, чтобы убедиться, что отдельные клетки равномерно распределены внутри матрицы (в 4 или 10 раз).
- Добавьте 1 мл предварительно подогретой 3D питательной среды в каждую лунку и 1,5 мл 3D питательной среды в каждую лунку камерного стекла и верните их в инкубатор.
