Анализ экстракции РНК: метод извлечения РНК из клеток рака легких, трансфицированных микроРНК

Аннотация

Источник: Hossian, A. K. M. N. et al., Анализ комбинаторных микроРНК для регуляции клеточного цикла и ангиогенеза. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео описывает протокол извлечения РНК из клеток рака легких, трансфицированных микроРНК. Этот подход может быть использован для определения активности комбинаторного лечения микроРНК в остановке клеточного цикла и ангиогенезе.

Протокол

1. Трансфекция miR-143 и miR-506

ВНИМАНИЕ: Используйте латексные перчатки, защитные очки и лабораторный халат во время проведения описанных экспериментов. При необходимости используйте шкаф биобезопасности с включенным вентилятором, не блокируя дыхательные пути и не нарушая ламинарный поток воздуха. Всегда устанавливайте защитное стекло на соответствующую высоту, указанную производителем.

1. Семена клеток NSCLC A549 в колбе T25 см² колбы/6/96 лунки в среде DMEM/F12K с добавлением 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина (питательные среды) в вытяжке для культуры тканей и инкубируют в течение ночи при 37 °C с 5%_CO2 в инкубаторе для тканевых культур.
2. Суспендируйте мимики miR-143 и/или miR-506 или скремблируйте миРНК с трансфективным агентом (2,4 мкг miR смешивали с 14 мкл трансфективного агента; см. таблицу материалов) в 500 мкл трансфекционной среды и 1,5 мл сыворотки и безантибиотиковых сред DMEM/F12K при конечной концентрации микроРНК 100 нМ. Количество микроРНК может потребовать оптимизации на различных клетках и концентрациях. Подходящие подходы включают трансфекцию клеток с возрастающими концентрациями микроРНК (т.е. 50-200 нМ) и оценку подавления экспрессии интересующих генов.
3. Удалите питательную среду из колбы/тарелки и промойте один раз 1x PBS.
4. Добавьте микроРНК/комплексы скрембл-трансфективных агентов и инкубируйте при 37 °C с 5%_CO2 в течение 6 ч (размер колбы определяет добавленный объем инкубации).
5. Замените среду 4 мл питательной среды и инкубируйте клетки в течение 24 ч и/или 48 ч.
6. Соберите трансфицированные клетки методом трипсинизации, добавив 1 мл трипсина-ЭДТА в каждую колбу T25 см², инкубируйте в течение 5-10 минут при 37 °C и добавьте 3 мл питательной среды для сбора клеток. Поместите содержимое каждой колбы в отдельную, помеченную пробирку объемом 15 мл. Работа в вытяжке для культуры тканей.
7. Центрифугируйте при 751 x g в течение 5 мин и удалите надосадочную жидкость.
   заметка: Во время удаления надосадочной жидкости требуется осторожность, так как перемешивание трубки может привести к потере клеток.
8. Добавьте 2 мл 1x PBS и центрифугируйте в течение 5 минут при 751 x g.
9. Повторите шаги 7 и 8 один раз, чтобы удалить любые следы среды и надосадочной жидкости.
   заметка: На этом этапе пробирки с образцами можно хранить при температуре -80 °C или использовать сразу.

2. Выделение РНК

1. Очистите рабочую зону, распылив 70% изопропиловый спирт и раствор для обеззараживания РНКазы.
2. Экстракцию РНК следует проводить с использованием соответствующего набора РНК (см. Таблицу материалов).
3. Снимите трубки с температуры -80 °C и дайте им оттаять. Добавьте 300 мкл буфера для лизиса и пипеткой вверх и вниз, чтобы разрушить клеточную мембрану.
4. Добавьте равный объем 100% ультрачистого этанола.
5. Хорошо перемешайте и поместите в разделительную колонну.
6. Центрифугируйте при давлении от 11 до 16 x g в течение 30 с и удалите проточный поток.
7. Добавьте 400 мкл промывочного буфера и центрифугу, чтобы удалить буфер.
8. Добавьте 5 μL DNAse I с 75 μL буфера для расщепления ДНК в каждый образец и инкубируйте в течение 15 минут.
9. Промойте образец 400 мкл буфера для подготовки РНК.
10. Промойте 2 раза с буфером для промывки РНК.
11. Добавьте в колонку воду, не содержащую нуклеаз, центрифугуйте, затем соберите РНК.
12. Измерьте общую концентрацию РНК с помощью УФ-спектрофотометра.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
A549 Клетки немелкоклеточного рака легких	АТКС	АТКС CCL-185
Ambion Silencer Negative Control No. 1 миРНК	Амбион	АМ4611
мимика миРНК has-miR-143-3p	ПРО	MCH01315
мимика миРНК has-miR-506-3p	ПРО	MCH02824
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Научный центр Фишера	10438026
Гидрохлорфосфатный буферный физиологический раствор (PBS)	Научный центр Фишера	SH30256FS
DMEM 4,5 г/л глюкозы, без пирувата натрия, с L-глутамином	ВВР	VWRL0100-0500
Ультрачистая дистиллированная вода без ДНКазы / РНКазы	Инвитроген	Тел.: 10-977-015
Наборы быстрых РНК	Исследование Zymo	Р1055
Этанол, абсолютный (200 пруф), класс молекулярной биологии,	Биореагенты Фишера	BP2818500
-80 °C Морозильная камера	ВВР	VWR40086A
Нанокапли	Термо Сайентиал	NanoDrop one C
Планшет на 96 лунок	CELLTREAT Научные	Тел.: 50-607-511
Пенициллин-стрептомицин 10/10	Антланта Биолакс	В21210
CO2-инкубатор	Термо Сайентиал	ГЕРАСЕЛЛ 150i
ДНКаза	Исследование Zymo	Е1010
F-12K Питательная смесь (Kaighn's Mod.) с L-глутамином, Corning	Корнинг	45000-354
Фетальная бычья сыворотка - Премиум	Антланта Биолакс	С11150
Центрифуга с регулируемой температурой матчин	Термо Сайентиал	СТ16Р
Микроцентрифуга с регулируемой температурой матчин	Эппендроф	5415R