1. Трансфекция miR-143 и miR-506
ВНИМАНИЕ: Используйте латексные перчатки, защитные очки и лабораторный халат во время проведения описанных экспериментов. При необходимости используйте шкаф биобезопасности с включенным вентилятором, не блокируя дыхательные пути и не нарушая ламинарный поток воздуха. Всегда устанавливайте защитное стекло на соответствующую высоту, указанную производителем.
- Семена клеток NSCLC A549 в колбе T25 см2 колбы/6/96 лунки в среде DMEM/F12K с добавлением 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина (питательные среды) в вытяжке для культуры тканей и инкубируют в течение ночи при 37 °C с 5%CO2 в инкубаторе для тканевых культур.
- Суспендируйте мимики miR-143 и/или miR-506 или скремблируйте миРНК с трансфективным агентом (2,4 мкг miR смешивали с 14 мкл трансфективного агента; см. таблицу материалов) в 500 мкл трансфекционной среды и 1,5 мл сыворотки и безантибиотиковых сред DMEM/F12K при конечной концентрации микроРНК 100 нМ. Количество микроРНК может потребовать оптимизации на различных клетках и концентрациях. Подходящие подходы включают трансфекцию клеток с возрастающими концентрациями микроРНК (т.е. 50-200 нМ) и оценку подавления экспрессии интересующих генов.
- Удалите питательную среду из колбы/тарелки и промойте один раз 1x PBS.
- Добавьте микроРНК/комплексы скрембл-трансфективных агентов и инкубируйте при 37 °C с 5%CO2 в течение 6 ч (размер колбы определяет добавленный объем инкубации).
- Замените среду 4 мл питательной среды и инкубируйте клетки в течение 24 ч и/или 48 ч.
- Соберите трансфицированные клетки методом трипсинизации, добавив 1 мл трипсина-ЭДТА в каждую колбу T25 см2, инкубируйте в течение 5-10 минут при 37 °C и добавьте 3 мл питательной среды для сбора клеток. Поместите содержимое каждой колбы в отдельную, помеченную пробирку объемом 15 мл. Работа в вытяжке для культуры тканей.
- Центрифугируйте при 751 x g в течение 5 мин и удалите надосадочную жидкость.
заметка: Во время удаления надосадочной жидкости требуется осторожность, так как перемешивание трубки может привести к потере клеток.
- Добавьте 2 мл 1x PBS и центрифугируйте в течение 5 минут при 751 x g.
- Повторите шаги 7 и 8 один раз, чтобы удалить любые следы среды и надосадочной жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе пробирки с образцами можно хранить при температуре -80 °C или использовать сразу.
2. Анализ клеточного цикла
- Засейте 5 x 105 клеток для каждого образца в колбу T25 см2 и выполните трансфекцию в соответствии с протоколом, описанным в разделе 1, шаги 1-5.
- Через 24 ч и 48 ч соберите клетки методом трипсинизации.
- Переложите клеточные суспензии в стерильные пробирки объемом 15 мл и промаркируйте их соответствующим образом.
- Центрифугируйте образцы при давлении 751 x g в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
- Добавьте 2 мл ледяного 1x PBS, вортекс и центрифугу при 751 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Повторите этап промывки с 1x PBS, чтобы удалить остатки среды.
- Повторно суспендируйте и разбейте гранулу, добавив 200 мкл ледяного 1x PBS путем пипетирования.
- Зафиксируйте ячейки, добавив 2 мл 70% ледяного этанола по каплям в трубку, осторожно перемешивая жидкость.
- Инкубируйте пробирки в течение 30 минут при RT и поместите пробирки при температуре 4 °C на 1 час.
- Удалите пробирки при температуре 4 °C и центрифугируйте при 751 x g в течение 5 минут.
- Добавьте 2 мл ледяного 1x PBS, вортекс и центрифугу при 751 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Добавьте 500 мкл 1x PBS с йодидом пропидия (50 мкг/мл) и рибонуклеазой А (200 мкг/мл).
- Инкубировать в течение 30 минут при РТ, защищая образцы от света.
- Получение данных на проточном цитометре. Используйте прямое и боковое рассеяние (FSC vs. SSC) для выбора основной популяции ячеек, исключая мусор в нижнем левом углу графика плотности FSC и кластеры ячеек в верхней правой части графика плотности FSC и SSC.
- Анализируйте данные для идентификации клеточных популяций на каждой стадии клеточного цикла с помощью соответствующего программного обеспечения.