$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Трансфекция miR-143 и miR-506
ВНИМАНИЕ: Используйте латексные перчатки, защитные очки и лабораторный халат во время проведения описанных экспериментов. При необходимости используйте шкаф биобезопасности с включенным вентилятором, не блокируя дыхательные пути и не нарушая ламинарный поток воздуха. Всегда устанавливайте защитное стекло на соответствующую высоту, указанную производителем.
- Семена клеток NSCLC A549 в колбе T25 см2 колбы/6/96 лунки в среде DMEM/F12K с добавлением 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина (питательные среды) в вытяжке для культуры тканей и инкубируют в течение ночи при 37 °C с 5%CO2 в инкубаторе для тканевых культур.
- Суспендируйте мимики miR-143 и/или miR-506 или скремблируйте миРНК с трансфективным агентом (2,4 мкг miR смешивали с 14 мкл трансфективного агента; см. таблицу материалов) в 500 мкл трансфекционной среды и 1,5 мл сыворотки и безантибиотиковых сред DMEM/F12K при конечной концентрации микроРНК 100 нМ. Количество микроРНК может потребовать оптимизации на различных клетках и концентрациях. Подходящие подходы включают трансфекцию клеток с возрастающими концентрациями микроРНК (т.е. 50-200 нМ) и оценку подавления экспрессии интересующих генов.
- Удалите питательную среду из колбы/тарелки и промойте один раз 1x PBS.
- Добавьте микроРНК/комплексы скрембл-трансфективных агентов и инкубируйте при 37 °C с 5%CO2 в течение 6 ч (размер колбы определяет добавленный объем инкубации).
- Замените среду 4 мл питательной среды и инкубируйте клетки в течение 24 ч и/или 48 ч.
2. Экспрессия белка с помощью микрочипа клеточного цикла антител
- Засейте 5 x 105 клеток для каждого образца в колбы T25 см2 и проведите трансфекцию в соответствии с протоколом, описанным в разделе 1, шаги 1-5.
- Через 24 ч и 48 ч собирают клетки методом трипсинизации.
- Перенесите клеточные суспензии в пробирки объемом 15 мл и промаркируйте их соответствующим образом.
- Центрифугируйте при 751 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
- Добавьте 2 мл ледяного 1x PBS, вортекс и центрифугу при 751 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Повторите этап стирки с 1x PBS.
- Добавьте 150 мкл буфера для лизиса, дополненного ингибиторами протеазы. Осторожно пипетируйте вверх и вниз, чтобы нарушить клеточные мембраны.
- Чтобы предотвратить интерференцию буфера для лизиса, выполните замену буфера для лизиса на буфер для маркировки, используя колонки для замены растворителей производителя.
- Количественное определение общего белка с помощью анализа BCA.
- Возьмите 70 г образца белка и добавьте буфер для мечения, чтобы получить окончательный объем 75 мкл.
- Добавьте 100 мкл диметилформамида (ДМФА) к 1 мг реагента биотина (биотин/ДМФА).
- Добавьте 3 мкл биотина/ДМФА в каждый образец белка (образец биотинилированного белка) и инкубируйте в течение 2 ч при РТ.
- Добавьте 35 μл стоп-реагента и перемешайте вортексом.
- Инкубируйте образцы в режиме RT в течение 30 минут.
- Перед использованием достаньте предметные стекла микрочипа из холодильника, чтобы они нагрелись до температуры RT в течение 1 часа.
- Для неспецифического связывания проводят блокирование путем инкубации предметных стекол с 3% раствором сухого молока (в блокирующем реагенте, предоставленном производителем) в чашке Петри с непрерывным встряхиванием в течение 45 мин при РТ.
- Промойте предметные стекла водой с ddH2O (если не указано иное, мойка происходит с помощью ddH2O).
- Повторите шаг мытья ~10 раз, чтобы полностью удалить блокирующий раствор с поверхностей слайдов. Это важно для достижения равномерного и низкого фона.
- Удалите излишки воды с поверхностей горки и перейдите к следующему шагу, не давая горкам высохнуть.
- Приготовьте раствор для сцепки, растворив 3% сухого молока в реагенте для сцепки.
- Добавьте 6 мл раствора для связывания и к полному количеству предварительно приготовленного образца биотинилированного белка из шага 12.
- Поместите одно предметное стекло в одну лунку соединительной камеры, предоставленной поставщиком, и добавьте в нее ~6 мл белковой соединительной смеси.
заметка: Убедитесь, что предметное стекло полностью погружено в раствор белковой соединительной смеси.
- Накройте камеру соединения и инкубируйте в течение 2 ч при RT с непрерывным перемешиванием в орбитальном встряхивателе.
- Переложите предметные стекла в чашку Петри и добавьте 30 мл 1x буфера для стирки. Поместите чашку Петри в орбитальный шейкер, встряхните в течение 10 минут и слейте раствор.
- Повторите шаг 24 2 раза.
- Тщательно промойте предметные стекла водой ddH2O, как описано в шагах 17 и 18, и немедленно перейдите к следующему шагу, чтобы избежать высыхания.
- Добавьте 30 мкл Cy3-стрептавидина (0,5 мг/мл) в 30 мл буфера для детектирования.
- Поместите предметное стекло в чашку Петри и добавьте 30 мл буфера для обнаружения, содержащего Cy3-стрептавидин.
- Инкубировать в орбитальном вибростенде в течение 20 мин при непрерывном встряхивании в защищенном от света месте.
заметка: Cy-3 является флуоресцентным красителем. Накройте алюминиевой фольгой или работайте в темноте для поддержания интенсивности флуоресценции.
- Выполните шаги 24-26 и дайте предметному стеклу высохнуть, используя слабую струю воздуха или поместив предметное стекло в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при давлении 1300 x g в течение 5-10 минут.
- Поместите слайд в держатель слайда и накройте алюминиевой фольгой.
- Отсканируйте предметное стекло на микрочиповом сканере с соответствующими длинами волн возбуждения и излучения. В случае Cy3 пик длины волны возбуждения находится на длине волны ~550 нм, а пик излучения — на длине волны ~570 нм.
- Проанализируйте данные (см. Таблицу материалов для используемого программного обеспечения).