Подготовка легких мыши к проточной цитометрии: получение клеточной суспензии из легочной ткани для проточного цитометрического анализа

Аннотация

Источник: Moll, H. P., et al. Ортотопическая трансплантация сингенных клеток аденокарциномы легкого для изучения экспрессии PD-L1. J. vis. Exp. (2019).

В этом видео описывается приготовление суспензии клеток легких мыши для проточного цитометрического анализа с целью изучения экспрессии PD-L1 в клетках аденокарциномы легкого.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка легких к проточной цитометрии

1. В желаемой экспериментальной конечной точке мышь усыпляют путем подкожной инъекции смеси кетамина (100 мг/кг массы тела) и ксилазина (10 мг/кг массы тела) и усыпляют путем вывиха шейки матки.
2. Замочите тушку в 70% этаноле и закрепите мышь на доске для вскрытия с помощью скотча.
3. Сделайте вентральный разрез по средней линии и аккуратно переверните кожу, чтобы обнажить мышцы грудной стенки и органы брюшной полости. Проколите диафрагму и разрежьте ножницами ребра, чтобы обнажить грудную полость.
4. Перфузируйте легкие 3 раза 6-8 мл ледяного PBS через правый желудочек с помощью иглы 27 G, предварительно вырезав небольшое отверстие в левом желудочке, чтобы позволить крови уйти. Легкие должны очиститься от крови и стать полностью белыми.
5. Выньте легкие и измельчите доли на мелкие кусочки с помощью ножниц. Перенесите кусочки легких в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл и инкубируйте ее в 1,5 мл буфера для разложения легких (RPMI, 5% FCS, 150 Ед/мл коллагеназы I и 50 Ед/мл ДНКазы I).
6. Инкубируйте кусочки легких в течение 30 - 60 минут при температуре 37 °C и при постоянном встряхивании.
7. Перенесите суспензию клеток легких через клеточный фильтр 70 мкм в пробирку объемом 50 мл. Очистите ситечко тыльной стороной стерильного шприца объемом 10 мл и промойте ситечко 15 мл PBS с 2% FCS.
8. Центрифугируйте клетки при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C и аспирируйте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 1 мл аммоний-хлоридно-калий-калийного (ACK) лизирующего буфера и инкубируйте их в течение 5 мин при комнатной температуре для лизиса остаточных эритроцитов.
9. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C и ресуспендируйте клетки в 1 мл PBS с 2% FCS и приступайте к желаемому протоколу окрашивания для проточной цитометрии
   заметка: В качестве альтернативы клетки могут быть ресуспендированы в RPMI, содержащем 30% FCS и 10% DMSO, и заморожены с использованием замораживающего контейнера для последующего анализа.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клеточная линия аденокарциномы легкого мыши			Изолированная собственная
C57Bl/6 мышей			Можно использовать F1 скрещивания двух фонов (8-12 недель)
Мыши 129S
RPMI 1640 Средний	Технологии Life	11544446
Фетальная сыворотка для теленка	Технологии Life	11573397
Раствор пенициллина/стрептомицина	Технологии Life	11548876
L-глютамин	Технологии Life	11539876
Кетасол (100 мг/мл кетамина)	Огрис Фарма	8-00173
Ксилазол (20 мг/мл ксилазин)	Огрис Фарма	8-00178
Тупые щипцы	Робоз	РС8260
Студенческие ножницы для радужной оболочки	Инструменты для точной науки	91460-11
ДНКаза I (без РНКазы)	Биолаборатории Новой Англии	М0303С
Коллагеназа I типа	Технологии Life	17100017
Лизирующий буфер ACK	Лонза	10-548Э

изоляция глаза