Иммунофлуоресцентный анализ: метод идентификации опухолевых клеток, захваченных на медицинской проволоке

Аннотация

Источник: Gallerani, G. et.al., Характеристика опухолевых клеток с использованием медицинской проволоки для захвата циркулирующих опухолевых клеток: 3D-подход на основе иммунофлуоресценции и ДНК FISH. J. VIS. EXP. (2017).

Это видео описывает технику иммунофлуоресцентного окрашивания циркулирующих опухолевых клеток, захваченных на функционализированной медицинской проволоке. Функционализированный провод позволяет изолировать ЦОК in vivo, непосредственно из кровотока пациента.

Протокол

1. Иммуно-ДНК FISH на проводе

1. Шиповка клеточной линии на проводе (поддержка 3D)
   заметка: Предварительная настройка включает в себя точный подбор адгезивных клеточных линий на основе EpCAM-позитивности. Проволока функционализирована антителами против EpCAM таким образом, что окрашиваются только EpCAM-положительные клетки.
   заметка: Не прикасайтесь к функциональной части провода во избежание повреждений.
   заметка: Все действия следует проводить под ламинарным вытяжным колпаком в стерильных условиях.
   1. Ресуспендируйте все содержимое колбы T75 (80% конфлюенция) во флаконе объемом 5 мл, используя 4 мл полной среды; для одного вставки рекомендуется использовать около 2 000 000 клеток, чтобы максимизировать адгезию клеток к проволоке.
   2. Извлеките провод из стеклянной упаковки.
   3. Опустите функционализированную золотую часть проволоки в флакон, убедившись, что стопор проволоки плотно прилегает к флакону. Запечатать лабораторной пленкой.
      заметка: Рекомендуется использовать пробирку объемом 5 мл, чтобы обеспечить правильное соответствие между проволочным ограничителем и флаконом.
   4. Инкубировать в течение 30 мин при РТ в трубочном ротаторе (угол 0-120).
   5. Промывайте провод три раза в растворе 1× PBS с использованием 3 разных чистых флаконов.
2. Фиксация и пермеабилизация
   осторожность: Ацетон является легковоспламеняющимся веществом, которое может раздражать дыхательные пути. Используйте только устойчивый к ацетону пластик или стеклянную тару (не ПВХ или ПВДФ).
   заметка: Выполняйте эти действия под вытяжным шкафом для химикатов.
   1. Проволоку высушите на воздухе.
   2. Зафиксируйте ячейки, опустив проволоку в 100% раствор ацетона на 10 мин в RT. Используйте пробирку объемом 5 мл. <бр/> заметка: Стопор не должен соприкасаться с фиксатором.
   3. Проволока просушить на воздухе в течение 5 минут при RT.
      заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь. Провод необходимо хранить при температуре -20 °C. При упаковке проволоки для длительного хранения поместите ограничитель проволоки рядом с функционализированным наконечником и осторожно вставьте проволоку в стеклянную трубку для хранения, стараясь не повредить функционализированный наконечник. Закройте стекло для хранения и храните (вертикально или горизонтально) при температуре -20 °C.
3. День иммунофлюоресценции 1
   заметка: Этот этап предполагает ночную инкубацию (~16 ч).
   1. Дважды промойте в растворе 1× PBS с помощью тюбика объемом 5 мл.
   2. Инкубируйте проволоку в буфере для разведения антител в течение 30 минут в режиме ОТ с использованием пробирки объемом 5 мл.
   3. Приготовьте 150 мкл смеси антител с разведением моноклонального первичного антитела, конъюгированного с флуорохромом, в буфере для разведения антител, как указано в техническом описании. Например, антитело EpCAM-FITC использовали в разведении 1:20.
   4. Используйте наконечник p200 для проведения инкубации следующим образом: извлеките проволоку из проволоки-стопора и аккуратно вставьте проволоку через большее отверстие кончика. Сначала вставьте нефункциональный конец и медленно протяните проволоку через меньшее отверстие, пока золотая часть не окажется сразу за большим отверстием.
   5. Аккуратно капните 150 μл смеси антител (например, anti EpCAM_FITC антитела в соотношении 1:20 разбавленные) в наконечник. Чтобы избежать риска образования пузырей, осторожно поворачивайте проволоку до полного погружения функционализированной части.
   6. Заклейте отверстие наконечника. Может помочь обертывание отверстия лабораторной пленкой.
   7. Инкубировать вертикально в течение ночи (~ 16 ч) в темноте при температуре 4 °C.
4. Иммунофлюоресценция 2 день
   1. Блокируйте инкубацию антител, дважды промывая проволоку через 1× PBS.
   2. Снова вставьте провод в его стопор.
      заметка: Хранить в 1X PBS при 4 °C во флаконе объемом 5 мл до проведения FISH-анализа.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
этанол	Карло Эрба	# 414605
Подросток 20	БИО РАД	# 1706531
PBS (фосфатно-солевой буфер)	Медикаго	# 09-9400-100
ацетон	Сигма Олдрич	# 534064-500МЛ
РЕЗИНОЦЕМЕНТ	Королевские таленсы	#95306500
EpCAM-FITC (клон: HEA-125)	Митеньи	#130-080-301
РПМИ 1640	Gibco	# 31870-025
XT ALK BA	Зонды MetaSystems	# D-6001-100-OG
Detektor CANCER01 EpCAM	Гилупи Наномедизин		Функционализированная проволока
Флуоресцентный микроскоп ZEISS Axioskop	ЦЕЙСС
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64-битное программное обеспечение	Компания Nikon
Nikon DS-QiMc 12-битный цифровой фотоаппарат	Компания Nikon	DS-QiMc