Экстракция микроРНК: метод извлечения микроРНК из образца плазмы

Аннотация

Источник: Mensah, M. et. al., Жидкая биопсия на основе микроРНК: опыт классификатора микроРНК плазмы (MSC) для скрининга рака легких. J. Vis. Exp. (2017).

МикроРНК (микроРНК) являются тканеспецифичными, малыми, некодирующими РНК, регулирующими экспрессию генов, и могут представлять собой идеальных кандидатов для раннего выявления рака легких. В представленном протоколе мы выделим микроРНК из образцов крови пациента для раннего скрининга рака легких.

Протокол

1. Сбор образцов плазмы

1. Соберите 10 мл образца цельной крови в вакуумные пробирки с покрытием K₂EDTA и храните при комнатной температуре.
   заметка: Чтобы свести к минимуму гемолиз, отделите плазму в течение 2 ч. Не храните цельную кровь при низкой температуре (т.е. 4 °C), чтобы избежать теплового шока и лизиса клеток, которые приводят к высвобождению неспецифической микроРНК.
2. В течение 1 ч разделите плазму с помощью первой ступени центрифугирования при 1 258 x g и 4 °C в течение 10 мин.
3. Перенесите надосадочную жидкость плазмы в пробирку объемом 15 мл, тщательно избегая контакта с лимфоцитарным кольцом.
4. Центрифугируйте плазму во второй раз при 1,258 x g и 4 °C в течение 10 мин.
5. Распределите 1 мл плазмы на 1,5 мл криовиалов, избегая сбора фракции плазмы у основания пробирки.
6. Храните все аликвоты при температуре -80 °C, за исключением одного для оценки гемолиза. Молекулярный анализ должен быть проведен в течение 5 недель.

2. Экстракция общей РНК в плазме

1. Приготовьте раствор 1-тиоглицерина/гомогенизации (OMG) с 20 мкл 1-тиоглицерина на мл раствора гомогенизации. Поскольку 1-Тиоглицерин вязкий, тщательно пипетируйте для точного измерения. Перед использованием охладите раствор OMG на льду или при температуре 2-10 °C.
   заметка: Рабочий раствор стабилен при температуре 2-10 °C в течение 1 месяца.
2. Суспензируйте лиофилизированную ДНКазу I, добавив в флакон 275 мкл воды, не содержащей нуклеаз, и аккуратно перемешайте (не завивайте). В качестве наглядного пособия добавьте 5 мкл синего красителя к восстановленной ДНКазе I и распределите раствор по одноразовым аликвотам в пробирках, не содержащих нуклеаз. Хранить восстановленную ДНКазу I при температуре от -30 °C до -10 °C.
3. Начиная с 200 мкл плазмы, добавьте 200 мкл охлажденного раствора OMG.
4. Vortex 15-30 с для обеспечения полной гомогенизации. Если происходит пенообразование, дайте образцу осесть на льду.
5. Добавьте 200 мкл буфера для лизиса и 25 мкл протеиназы К в гомогенизированный образец и сделайте вихрь на 20 с.
6. Инкубируйте образцы в течение 15 минут в термомиксере, нагретом до 37 °C.
7. Загрузите картридж для каждого образца на палубный лоток прибора и установите заглушку в нужное положение.
8. Перенесите лизат в соответствующее положение в картридже прибора.
9. Добавьте 5 μL раствора DNase I в нужное положение в картридже.
10. Добавьте 60 мкл воды, не содержащей нуклеаз, в основание каждой элюирующей пробирки.
11. Выберите метод «Ткань микроРНК РСК» и начните автоматический цикл очистки. Общее количество образцов РНК может храниться при температуре −80 °C.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1x PBS	Лонза	БЕ-17-516
Буфер 20xTE, pH 8,0	Молекулярный зонд	Т11493	Разбавьте стоковый раствор 20X до конечной концентрации 0,1X в воде, не содержащей нуклеаз
Вода без нуклеаз
Набор микроРНК Maxwell RSC Tissue Kit	Компания Promega	АС1460	Набор содержит раствор для гомогенизации, ДНКазу I, протеиназу К, буфер для лизиса и картриджи. При приеме 1-тиоглицерина следует избегать ингаляций и контакта с кожей и глазами. Используйте его под вытяжным шкафом.
Vacutainer Safe-Lock Набор для сбора крови	Бектон Дикинсон	367286-364815 (Английский
Вихревой смеситель	Велп Науча	F202A0173
Термомиксер Т-шейкер	Евроклон	А00564	Доведите термомиксер до 37 °C перед началом экстракции РНК
Прибор РСК Максвелла	Компания Promega	АС4500
Криогенные флаконы 1,5 мл	Сигма-Олдрич	Z359033