$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Секционирование GMA.
- Приготовьте 0,05% раствор аммиака с дистиллированной водой. Поместите стеклянный нож и биопсию в микротом. Тщательно выровняйте биопсийный блок с лезвием, отрегулировав держатель ножа и угол наклона биопсийного блока так, чтобы лезвие ровно прилегало к поверхности блока.
- Отрежьте срезы толщиной 2 мкм с помощью микротома на медленной скорости резки и с помощью щипцов перенесите и всплытие срезов на аммиачной воде. Поместите срезы на 45-90 секунд, обеспечивая бережное извлечение антигена и разворачивание среза.
- Поднимите срезы предметным стеклом микроскопа. Проверьте гистологию биопсии путем быстрого окрашивания толуидиновым синим.
- Высушите предметные стекла на горячей плите, установленной при температуре 50 °C, и нанесите 500 μл отфильтрованного синего цвета толуидина на срез с помощью пластиковой дозатора Пастера. Прогрейте участок на горячей плите до тех пор, пока на краю пятна не начнет появляться зеленое кольцо, а затем смойте его водой.
- С помощью светового микроскопа проверьте гистологию биопсии. Срезы, используемые для иммуногистохимии, должны содержать хорошие участки неповрежденной собственной пластинки и эпителия, с как можно меньшим количеством желез и гладких мышц.
- Вырежьте срезы с хорошей гистологией и возьмите их с помощью предметных стекол микроскопа с покрытием из поли-L-лизина (PLL-покрытия) для иммуногистохимического окрашивания. Вырежьте не менее двух срезов из каждой биопсии для анализа. Сушите предметные стекла не менее 1 часа. После высыхания секции можно завернуть в оловянную фольгу и хранить при температуре -20 °C до 2 недель, или же на них можно сразу нанести иммуномутное окрашивание.
2. Иммуногистохимическое окрашивание эндобронхиальных биопсий, встроенных в GMA
ПРИМЕЧАНИЕ: Азид натрия токсичен. Приготовьте 0,1% раствор азида натрия в вытяжном шкафу вдали от кислот. При контакте с кислотами выделяется токсичный газ.
- Нарисуйте секции с помощью ручки с алмазным наконечником и разложите слайды на решетке для окрашивания.
- Выполните блокирование пероксидазой. Приготовьте блочный раствор пероксидазы из 0,3% перекиси водорода в 0,1% растворе азида натрия. Нанесите на срезы 1 мл пероксидазного блока и инкубируйте в течение 30 минут.
- Приготовьте промывочный раствор из 0,05 М Трис-буферного физиологического раствора (ТБС), pH 7,6. Вымойте предметные стекла в TBS, 3x 5 мин.
- Приготовьте 1% блочный раствор BSA в DMEM. Сделайте это заранее и в больших объемах, аликвотируйте и заморозьте его до тех пор, пока не понадобится. Слейте воду из предметных стекол и инкубируйте срезы в блочном растворе в течение 30 минут, чтобы блокировать связывание неспецифических антител. Если неспецифическое связывание все еще происходит, включите 30-минутный этап инкубации с 5% сывороткой крови того же вида, что и вторичное антитело.
- Разбавлять первичное антитело (CD45 или CD1a) в TBS до желаемой концентрации (CD45 разбавлять в соотношении 1:1000; CD1a разбавляют в соотношении 1:1,00) и наносят его на предметные стекла. Накройте секции и инкубируйте на ночь в RT.
- Вымойте слайды в TBS три раза. Разведите биотинилированное вторичное антитело (направленное против первичного вида антитела-хозяина, в данном случае кролика против мыши F(ab'2)) в TBS до желаемой концентрации (разведение 1:300) и нанесите его на предметные стекла. Инкубировать в течение 2 часов при RT.
- Приготовьте стрептавидин-биотинпероксидазный комплекс не менее чем за 30 минут до применения. Убедитесь, что их достаточно, чтобы покрыть все горки. Вымойте горки в TBS три раза. Нанесите раствор на предметные стекла и инкубируйте в течение 2 часов при RT.
- Вымойте горки в TBS три раза. Приготовьте субстрат 3-амино-9-этилкарбазола (АЭС) пероксидазы (изготовленный в соответствии с инструкцией производителя). Нанесите его на предметные стекла и выдерживайте в течение 20-30 минут или до тех пор, пока не разовьется желаемая интенсивность пятна.
- Промойте предметные стекла в проточной водопроводной воде в течение 5 минут. Прокройте срезы фильтрованным раствором гематоксилина Майера в течение 2 минут. Промойте стекла в проточной водопроводной воде в течение 5 минут.
- Слейте воду с горок и накройте секции постоянным водным монтажным материалом. Высушите предметные стекла при температуре 80 °C в сушильном шкафу. Дайте предметным стеклам остыть, а затем закрепите их с помощью DPX и установите защитное стекло.