1. Выделение экзосом
Примечание: Выделение экзосом из образцов плазмы было выполнено с помощью коммерческого набора, в соответствии с протоколом производителя и путем добавления обработки РНКазой: (все эти шаги должны быть выполнены с использованием средств индивидуальной защиты и защиты окружающей среды и в соответствии со специальной юридической процедурой для манипуляций с биологическими образцами).
- Возьмите по 1 мл плазмы каждого образца, хранящейся при температуре -80 °C, и поместите ее на лед.
- Центрифугируйте образец при концентрации 2000 × г в течение 20 мин при RT; этот проход является обязательным для удаления клеток и мусора.
- Перенесите надосадочную жидкость, содержащую чистую плазму, в новую пробирку объемом 1,5 мл.
- Центрифугируйте новую пробирку при давлении 10 000 × г в течение 20 минут при RT.
- Перенесите надосадочную жидкость, содержащую чистую плазму, в новую пробирку объемом 1,5 мл.
- Добавьте 100 нг/мл РНКазы в надосадочную жидкость и инкубируйте пробирку при 37 °C в течение 10 минут, чтобы разрушить циркулирующие РНК.
- Переложите всю обработанную плазму в новую пробирку объемом 2 мл и добавьте 0,5 объема 1x PBS.
- Сделайте образец вихревым для того, чтобы перемешать растворы.
- Добавьте к образцу 0,05 объема раствора протеиназы К (прилагается к набору).
- Обработайте образец вихрем, а затем инкубируйте при 37 °C в течение 10 минут.
- Добавьте в образец 0,2 объема буфера для осаждения экзосом и перемешайте растворы путем инверсии.
- Инкубируйте образец при температуре от 2 °C до 8 °C в течение 30 минут, а затем центрифугируйте образец при 10 000 × г в течение 5 минут при RT.
- Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость. Гранула содержит выделенные экзосомы.
- Добавьте выбранный буфер в гранулу экзосомы для того, чтобы ресуспендировать экзосомы. Выбор буфера зависит от планируемого анализа на последующих этапах, в данном случае:
- Добавьте 100 мкл 1x PBS для выполнения анализа TEM.
- Добавьте 346,5 мкл специфического буфера для лизиса для извлечения РНК (из коммерческого набора) (ВНИМАНИЕ: химическая опасность).
- Добавьте 100 мкл лизисного буфера для экстракции белка (Tris-HCl 50 мМ pH 7,6 - NaCl 300 мМ - Triton X-100 0,5% - PMSF 1 мМ - лейпептин/апротинин 10 мкг/мл) для проведения вестерн-блоттинга. (ВНИМАНИЕ: химическая опасность).
- Храните ресуспендированные экзосомы при температуре −20 °C.
