3D ДНК РЫБ: метод определения местоположения определенного гена на хромосоме

Аннотация

Источник: Gallerani, G. et.al. Характеристика опухолевых клеток с использованием медицинской проволоки для захвата циркулирующих опухолевых клеток: 3D-подход на основе иммунофлуоресценции и ДНК FISH. J. VIS. EXP. (2017).

Выделение и характеристика циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) из крови больных раком является разновидностью неинвазивной жидкостной биопсии и связана с рецидивом и прогрессированием заболевания. В этом видео описывается методика флуоресцентной гибридизации ДНК in situ (DNA FISH) на ЦОК, захваченных на медицинской проволоке, для изучения конкретного гена, представляющего интерес.

Протокол

1. 3D DNA-FISH День 2

ВНИМАНИЕ: Особое внимание следует уделять высокой температуре инструментов и влажной камере.

1. Настройте печь для гибридизации и печь с сухим жаром (~ за 3 ч до начала протокола DNA-FISH). Установите гибридизационную печь на 75 °C, установите сушильную печь на 37 °C и охладите 0,4× раствор SSC (pH = 7,0 ± 0,1) до 4 °C.
   заметка: Уровень pH буферов FISH является критическим и должен составлять 7,0 ± 0,1.
2. Промойте провод 3 раза в ледяном 0,4× растворе SSC.<бр/> заметка: Держите провод в темноте, чтобы избежать фотообесцвечивания флюорохромом во время следующих процедур.
3. Сушить 10 минут в темноте под вытяжным шкафом.
4. Сделайте вихрь и вращайте зонд в течение 5 с.
5. Капните 10 μл зонда в стеклянные микропробирки. Накрыть лабораторной пленкой.
6. Закрутите микротрубки следующим образом: оберните микротрубку в сухой абсорбент, положите бумагу в пробирку объемом 50 мл и коротко отверните.
7. Осторожно поместите высушенную проволоку в микротрубку и вставьте проволоку-стопор. Герметизация резиновым цементом.
   осторожность: Следующие два шага связаны с высокими температурами. Надевайте защитные перчатки.
8. Поместите проволоку в темную влажную камеру в гибридизационной печи на 8 минут при температуре 75 °C для получения полной денатурации ДНК.
9. Переместите влажную камеру в духовку с сухим жаром при температуре 37 °C на ночь.

2. 3D DNA-FISH День 3

1. Поставьте банку для окрашивания предметного стекла с 0,4× раствором SSC на водяную баню и установите при температуре 72 °C.
2. Проверяйте температуру раствора 0,4× SSC до тех пор, пока она не достигнет 72 ± 1 °C.
3. Приготовьте два стеклянных стакана, один из которых содержит 2× раствор SSC + 0,05% Tween (pH = 7,0 ± 0,1), а второй — дистиллированную воду.
4. Выньте влажную камеру из духовки с сухим жаром, осторожно удалите резиновый цемент с проволочного стопора с помощью пинцета и выньте проволоку.
   заметка: Осторожно протяните конец проволоки без покрытия через IN-Stopper, стараясь не повредить функционализированный наконечник.
5. Опустите проволоку в раствор SSC 0,4× на 2 минуты при температуре 72 °C.
6. Промыть провод в 2× SSC + 0,05% растворе Tween в течение 30 с при RT.
7. Промойте провод в дистиллированной воде при RT.
8. Просушите провод под вытяжным шкафом в течение 10 минут в темноте.
9. Приготовьте стоковый раствор DAPI в концентрации 1,43 мкМ в 2 мл 1× PBS.
10. Инкубируйте функционализированный наконечник проволоки с раствором DAPI во флаконе объемом 2 мл в течение 1 ч в темноте при РТ.
11. Промойте провод дважды в 1× PBS и высушите на воздухе.

3. 3D наблюдение и анализ под микроскопом

1. Поместите провод в держатель провода. Осторожно вставьте функционализированный наконечник через точку входа специального держателя, пока наконечник не совпадет с точкой соединения. Будьте осторожны, чтобы не повредить функционализированный наконечник (Рисунок 1a).
2. Поместите специальный держатель на предметный столик микроскопа. Отрегулируйте фокусировку микроскопа с помощью объектива 20×. Сначала грубо сфокусируйтесь на специальной поддержке, а затем тонко отрегулируйте на ячейках, которые кажутся яркими в DAPI-канале.

Результаты

Рисунок 1: Функционализированный провод, схематическое расположение разрывных преобразователей ALK, схема ожидаемых схем перегруппировки ALK и специальный держатель.(a) Красными прямоугольниками выделены три основные части проволоки: функционализированный наконечник, проволочный стопор и нефункционализированный наконечник. Функциональный наконечник является самой дел...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Подросток 20	БИО РАД	#1706531
Vysis 20X SSC (66г)	Abbott Molecular Inc.	# 30-804850	Порошок должен быть суспендирован в дистиллированной воде, как рекомендуется
Вода	Многопоровые
DAPI, марка FluoroPure	Инвитроген	# Д21490
Флуоресцентный микроскоп ZEISS Axioskop	ЦЕЙСС