Консервация тканей с фиксированным формалином парафином (FFPE): метод изучения морфологии тканей

Аннотация

Источник: Nagaraj A.S., et al., Установление и анализ эксплантов опухолевых срезов как предпосылка для диагностического тестирования. J. Vis. Exp. (2018)

В следующем видео описывается, как сохранить морфологию ткани с помощью фиксации формалина и встраивания парафина.

Протокол

1. Фиксация и обработка срезов тканей

1. Осторожно поднимите некультивированный эталонный или культивированный ломтик на фильтровальную бумагу, смоченную в PBS.
   1. Для этого добавьте 2-3 мл PBS поверх фильтровальной бумаги, помещенной в 10-сантиметровую пластину. Положите срез поверх фильтровальной бумаги и извлеките фильтровальную бумагу с помощью щипцов.
   2. Переложите фильтровальную бумагу в гистокассету и добавьте каплю разведенного гематоксилина (1:1 в деионизированной воде) поверх среза ткани, чтобы заметно обозначить положение среза во время последующих этапов обработки (Рисунок 1D).
   3. Закройте кассету и переложите ее в 4% нейтральный буферизованный раствор формалина. Зафиксируйте салфетки на ночь при температуре 4 °C.
      заметка: Положив ломтик поверх фильтровальной бумаги, убедитесь, что верхняя часть среза обращена вверх; Это необходимо для того, чтобы следить за верхней, средней и нижней частями среза во время разреза и анализа, как описано в шаге 2.3.
2. На следующий день переведите кассеты в 70% EtOH и сразу же приступайте к этапу обработки ткани, закладывающей парафин.
3. Перед обработкой тканей промойте гистоказетты в 100% EtOH 2x в течение 10 минут каждая. В этом случае для обработки тканей используют микроволновую станцию. Выберите программу, используемую для толщины ткани 1 мм, и следуйте инструкциям, приведенным в инструкции (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
   заметка: При использовании других машин для обработки тканей используйте программу, подходящую для тонких образцов тканей.
4. Для заделки парафина откройте гистокассету и с помощью скальпеля осторожно снимите кусочек с фильтровальной бумаги. Выбросьте фильтровальную бумагу и переложите ломтик в форму, содержащую жидкий парафин.
   1. Прижмите ткань к дну закладной формы, например, с помощью плоского груза, чтобы обеспечить равномерное сечение. Поместите нижнюю часть гистоказета поверх формы, сверху добавьте жидкий парафин. Дайте форме остыть на холодном пашете в течение 30 минут, и отделите форму от парафинового блока.
      заметка: В качестве альтернативы горизонтальному встраиванию можно встроить опухолевый срез вертикально, расположив срез в вертикальном положении. Вертикальные сечения позволяют легко анализировать градиенты жизнеспособности или экспрессии функциональных маркеров на одном участке. Градиентный анализ с горизонтально заложенными срезами требует секционирования парафина, как описано в шаге 2.2.

2. Обработка и анализ фиксированных формалином и залитых парафином (FFPE) тканей

1. Приготовьте тонкие срезы 4 мкм блоков для среза ткани FFPE с помощью микротома. При секционировании отрегулируйте угол наклона блока так, чтобы поверхность блока была горизонтально ориентирована по отношению к лезвию; Это необходимо для получения ровных участков по всей ткани.
2. Чтобы обеспечить захват потенциального индуцированного культурой градиента жизнеспособности, миграции клеток через срезы или градиентов экспрессии биомаркеров в культивируемых срезах, соберите срезы из верхнего, центрального и нижнего слоев каждого из срезов ткани на предметных стеклах, как описано ниже.
3. Соберите последовательные срезы ткани среза ткани, залитого парафином, сначала на верхней части стеклянных стекол. Продолжайте собирать срезы более глубоких слоев тканей к середине, а затем к нижней части стеклянных стекол (Рисунок 1E).
   заметка: Чтобы разместить три секции на предметном стекле, обрежьте избыток парафина вокруг встроенного среза ткани.
4. Дайте срезам высохнуть в течение ночи при температуре 37 °C и приступайте к окрашиванию H&E или иммуногистохимии, как описано ниже.
   заметка: Потеря антигенности может произойти при хранении срезов FFPE при высоких температурах или в течение длительного периода времени. Парафиновые срезы рекомендуется хранить при температуре 4 °C, а анализы ИГХ следует проводить в течение 6 месяцев после срезов.
   1. Для окрашивания H&E депарафинизируйте и регидратируйте парафиновые срезы следующим образом: ксилол 3x в течение 5 мин, 100% EtOH 3x в течение 1 мин, 96% EtOH 2x в течение 1 мин, 70% EtOH 1 x 1 мин и деионизированная вода 2x в течение 1 мин.
   2. Секции инкубировать в свежеотфильтрованном растворе гематоксилина в течение 10 мин и промыть под проточной водой из-под крана в течение 5 мин. Срезы опустить в кислый спирт (1% HCl в 70% EtOH) на 2 мин и промыть под проточной водой из-под крана в течение 5 мин с последующей инкубацией с 0,5% эозином в течение 2 мин.
   3. После этапа эозина обезвоживайте срезы, погружая стекла в растворы спирта и ксилола следующим образом: 96% EtOH 2x в течение 15 с, 100% EtOH 3x в течение 30 с, ксилол 3x в течение 1 мин. Наконец, заделайте секции в монтажную среду на основе ксилола.

Результаты

Рисунок 1: Схематическое изображение рабочего процесса для создания и анализа эксплантов срезов мышиных опухолей НМРЛ.(А) Схематическое описание сбора и подготовки опухолевых легких к срезу. Доли легких собираются у мыши, и опухолевая ткань рассекается вдали от нормальной ткани. Черная стрелка и звездочка указывают на опухоли размером примерно 4 мм и 1 мм соответственно. Белая стрелк...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Планшет для культивирования тканей 10 см	Сарштедт	83.1802
ПБС	Лонза	БЭ17-517К
формальдегид	рыбак	Ф/1501/PB08
Трехкратная гистоскопная кассетная бумага	Диагностика рака	DX26280
Гистокассеты	ВВР	720-2199
микротом	Thermo Fischer Scientific	ХМ355С
Микротом с вибрационным лезвием Leica VT1200 S	Leica Biosystems	14048142066
Гематоксилин для окрашивания H&E	Мерк	1.09249.0500
Гематоксилин для встречного окрашивания	Дако	С3309
эозин	сигма	Е4382
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS)	сигма	Н6648