$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка клеток и среды
- Приготовьте среду, используя 240 мл модифицированной среды Dubecco's Medium (IMDM) от Iscove и 50 мл эмбриональной бычьей сыворотки. Не размораживайте фетальную бычью сыворотку на бане с горячей водой, так как быстрое повышение температуры может привести к нарушению стабильности сыворотки. Соедините 240 мкл гентамицина 50 мг/мл и 5 мл пенициллина/стрептомицина 100x в стандартной колбе для культур и добавьте в среду. Хранить среду при температуре 4°C.
- Высейте клетки U937 в концентрации ~4 х 10по 4 клетки/мл в колбу 2 см 2 с использованием подготовленной среды. Оцените концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью счетчика клеток TC20 и исключения трипанового синего путем помещения 15-20 μл клеток и 15-20 μл трипанового синего в микроцентрифужную пробирку и смешивания содержимого. Нанесите 15-20 мкл этой смеси в предметное стекло TC20 и начните подсчет, поместив предметное стекло в счетчик элементов TC20.
- Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%CO2 и проверьте жизнеспособность клеток с помощью исключения трипанового синего и счетчика клеток TC20. Когда клетки находятся в соответствующей концентрации и/или были обработаны соносенсибилизаторами в течение соответствующего периода времени, перенесите 3 мл клеток из колбы для культур в стеклянный сцинтилляционный флакон объемом 20 мл. В соответствии с этим протоколом клетки U937 выращивают в течение 48 часов, а затем обрабатывают 0,5, 1 или 5 мМ MeβCD в течение 30 минут, чтобы достаточно истощить уровень холестерина в клетках перед ультразвуковым исследованием.
2. Клеточная ультразвук
- Дегазированная дегазированная, дистиллированная вода с помощью вакуума и колбы Бюхнера. Перелейте воду в рожок чашки и наполните до уровня 15 мм выше верхней части рожка. Процесс ультразвуковой обработки вызывает дальнейшую дегазацию воды в течение нескольких минут и может привести к несоответствиям в ходе эксперимента, если система не будет запущена до обработки образцов ультразвуком. Поэтому запустите систему в течение ~7 минут перед ультразвуковой обработкой.
- Прикрепите сцинтилляционный флакон с клетками к удерживающему устройству. Затем прикрепите удерживающее устройство к верхней части чашечки рожка и установите его на отметку 15 мм от верхней части горна (у поверхности воды с помощью скользящего механизма).
- Клетки обычно обрабатываются ультразвуком с использованием трех ультразвуковых импульсов продолжительностью 1 секунда с интервалом в 1 секунду между каждым из этих импульсов. Для этого протокола обрабатывайте клетки ультразвуком с амплитудой 33% и 50% с использованием вышеупомянутого импульсного дозирования.
3. Оценка клеток на предмет повреждений после ультразвуковой
обработки
- Оцените взвешенные клетки на предмет повреждений и жизнеспособности с помощью трипанового синего и счетчика клеток TC20. Кроме того, проанализируйте образец с помощью счетчика Z2. Для анализа Z2-счетчика пипетку пипетку 100 мкл клеточной суспензии в 20 мл изотонического раствора (соотношение 200:1). Перед анализом не менее двух раз промойте отверстие анализатора частиц Z2 с помощью изотонического раствора. Поместите образец Z2 в держатель счетчика и поднимите платформу до отверстия перед началом подсчета.
- Получайте данные со счетчиков TC20 и Z2 с помощью программного обеспечения, предоставленного производителем. Проанализируйте эти данные на предмет повреждения клеток, жизнеспособности и создания клеточного мусора в результате ультразвуковой обработки.