Анализ XTT: колориметрический анализ для оценки жизнеспособности клеток и митохондриальной активности

Аннотация

Trendowski, M., et al. Генерация и количественный анализ импульсного низкочастотного ультразвука для определения звуковой чувствительности неопластических клеток без лечения и лечения. J. vis. Exp. (2015)

В этой статье описывается протокол анализа XTT, который представляет собой колориметрический анализ для оценки жизнеспособности клеток и митохондриальной активности.

Протокол

1. Анализ XTT для определения жизнеспособности клеток и митохондриальной активности обработанных клеток U937 и THP1

1. Перед анализом XTT выращивайте клетки U937 и THP1 в тех же условиях. Предварительно обрабатывайте клетки с тем же диапазоном концентраций MeβCD в течение 30 минут перед ультразвуковой обработкой. Используйте те же параметры ультразвука, что и раньше, за исключением того, что клетки теперь обрабатываются ультразвуком с использованием диапазона импульсов в 1-3 секунды с интервалом в одну секунду друг от друга><, чтобы определить диапазон повреждений для оценки набором XTT. заметка: Многие из этих шагов взяты непосредственно из руководства по набору XTT и повторяются только для удобства заинтересованных лабораторий.
2. Соберите клетки центрифугированием при 200 х г в течение 10 мин. Ресуспендируйте клеточную гранулу в ранее описанной питательной среде. Ресуспендируйте клетки со скоростью ~1 x 10⁵ клеток/мл. Засейте клетки U937 по 100 мкл на лунку в 96-луночный микротитровальный планшет с плоским дном в трех экземплярах, а затем повторите для клеток THP1 с использованием отдельного 96-луночного планшета. Включите 3 контрольные лунки, содержащие 100 μл полной питательной среды в качестве пустых показаний поглощения. Затем инкубируйте инокулированные планшеты в течение 24 часов.
3. Перед применением разморозьте две аликвоты реагента XTT и активационного реагента при 37 °C. Аккуратно взболтайте аликвоты до получения прозрачных растворов. Добавьте 0,1 мл активационного реагента к 5,0 мл реагента XTT, что образует достаточное количество активированного раствора XTT для одного анализа на 96-луночных микротитровых планшетах. Повторите процесс для другой тарелки.
4. Добавьте по 50 мкл раствора активированного XTT в каждую лунку. Верните планшет в инкубатор для клеточных культур CO₂ на 2 часа. Осторожно встряхните пластину после инкубационного периода, чтобы равномерно распределить оранжевый цвет в положительных лунках. Измерьте поглощение пробирных лунок, содержащих клетки, и контрольных лунок холостого фона на длине волны 450-500 нм с помощью считывателя микротитровальных планшетов.
5. Либо обнулите считыватель микротитровальных планшетов с помощью контрольных лунок с глухими отверстиями, либо вычтите их среднее значение из конкретных результатов. Снова измерьте поглощение всех пробирных лунок на длине волны в диапазоне 630-690 нм и вычтите значения из полученных значений 450-500 нм. Примечание: Это второе определение абсорбции помогает исключить неспецифические показания из результатов анализа. Анализ XTT повторяли четыре раза для обеих клеточных линий.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Модифицированный Дульбекко Medium с NaHCO3 и 25mM Hepes	Технологии Life	12440079
Разрушитель ячеек Branson SLPe 40 кГц с 3 дюйма (25 мм) Cuphorn	Брэнсон Ультразвук	Тел.: 101-063-726	ультразвуковая обработка<бр /> устройство
Наконечник One 100 мкл и 1 000 мкл Фильтрующие наконечники	США Сайентифик	1120-1840, 1126-7810
100 мкл Микропипетка	Уитон	851164
1000 μл Микропипетка	Уитон	851168
Forma Scientific Двухкамерный водяной<бр /> Инкубатор с рубашкой	Форма Научная	No 3131
Набор для анализа пролиферации клеток XTT	АТКС	30-1011К
96-луночный считыватель микропланшетов	Коул-Палмер	EW-13055-54
U937 Клетки моноцитарного лейкоза человека	АТКС	CRL1593.2
THP1 Клетки моноцитарного лейкоза человека	АТКС	ТИБ-202