Анализ на мечение импульса бромоксиуридином (Bromodeoxyuridine): метод измерения пролиферации клеток

Аннотация

Источник: Welschinger R. et al. Временное отслеживание прогрессии клеточного цикла с помощью проточной цитометрии без необходимости синхронизации. J. vis. Exp. (2015)

В видео описывается поэтапный анализ импульсного мечения клеток млекопитающих с помощью бромодоксиуридина (BrdU) для измерения пролиферации клеток. Поглощение BrdU позволяет отслеживать во времени клетки, которые находились в фазе синтеза в определенный момент времени, не требуя синхронизации клеток.

Протокол

1. Растворы и реагенты

1. Полный RPMI
   1. Добавьте 56 мл фетальной телячьей сыворотки (FCS) и 5,5 мл 200 мМ L-глютамина во флакон среды RPMI-1640 объемом 500 мл.
2. Складское решение BrdU
   1. Приготовьте 32,5 мМ BrdU (10 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS).
3. BrdU Полный RPMI
   1. Добавьте 6,2 мкл стокового раствора BrdU в 10 мл Complete RPMI.
4. Решение DNase
   1. Приготовьте 1 мг ДНКазы/мл в DPBS.
5. Буфер для окрашивания
   1. В ДПБС готовят 3% термоинактивированный ФТС и 0,09% азид натрия.
6. Обратитесь к Списку материалов для определения фиксирующего буфера, буфера для пермеабилизации и буфера для промывки.

2. Клетки

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки не культивировались более 6 месяцев. Этот метод может быть непосредственно адаптирован к любой неадгезивной клеточной линии с корректировкой плотности клеток и питательных сред. Используйте клетки, которые растут экспоненциально на момент начала эксперимента.

1. Поддерживайте клетки NALM6 в колбах с культурой T-75 в Complete RPMI. Выполняйте все шаги в стерильных условиях, используя шкаф биобезопасности класса II.
2. Поддерживайте клетки NALM6 в диапазоне 1-2 x 10⁶ клеток на мл путем расщепления культуры три раза в неделю.
3. Инкубировать при 37 °C при 5%_CO2 на воздухе.

3. Импульсное мечение клеток с помощью BrdU

ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с BrdU осторожно, так как это потенциальный мутаген и тератоген.

1. Центрифужные ячейки при плотности 150 x g в течение 5 мин.<бр/> заметка: Перенос клеток в свежую среду улучшает воспроизводимость результатов.
2. Выполните подсчет клеток и ресуспендируйте клетки в Complete RPMI при концентрации 2 x 10⁶ клеток/мл.
3. Разбавьте клетки 1 в 2 с помощью BrdU Complete RPMI, получив конечную концентрацию клеток 1 x 10⁶ клеток/мл.
4. Инкубировать при 37 °C с 5%_CO2 в течение 45 минут, затем разбавить клетки 1 к 10 полной RPMI. Центрифугируйте ячейки при давлении 150 x g в течение 5 минут и тщательно удалите весь надосадочный жидкость.
5. Ресуспендируйте клетки в небольшом объеме (~100 μл) от полного RPMI, выполните подсчет клеток и отрегулируйте до 1 x 10⁶ клеток/мл.
6. Пипеткой внесите 1 мл клеток в лунки 48 луночного планшета. Пипеткой введите 1 мл DPBS в любые незанятые лунки для получения более воспроизводимых результатов.
7. Инкубируйте при 37 °C при 5%_CO2 на воздухе для желаемых временных точек, здесь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 и 24 ч.<бр/> заметка: Продолжительность времени будет зависеть от того, на что направлен план эксперимента.
8. Перенесите все клетки в пробирки FACS с помощью пипетки. Последовательно промойте лунку 1 мл PBS до конечного общего объема 5 мл.
9. Центрифугируйте при 150 х г в течение 5 мин и тщательно удалите всю надосадочную жидкость. Клетки готовы к окрашиванию, выполняйте это (раздел 4) незамедлительно.

4. Окрашивание клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется поверхностное окрашивание клеток, выполните его перед фиксацией, убедившись, что клетки поддерживаются при температуре 4 °C на протяжении всего процесса.

1. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл окрашивающего буфера (для необязательного окрашивания поверхности добавьте рекомендуемый объем антитела к поверхностным антигенам и инкубируйте в течение 30 мин при 4 °C).
2. Добавьте 1 мл буфера для окрашивания, центрифугируйте в течение 5 минут при 150 x g и выбросьте надосадочную жидкость.
   Примечание: Специфические антитела, концентрация, время инкубации и т. д. будут варьироваться в зависимости от конкретных целей эксперимента.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
НАЛМ6	ДСМЗ	АСС-128
5-Бромо-2'-дезоксиуридин	сигма	Б5002-1Г
RPMI 1 640 без L-Gln 500 мл	Лонза	12-167Ф
ДПБС	Лонза	17-512Ф
Фетальная бычья сыворотка	ФишерБиотек	ФБС-7100113
CO2-инкубатор	сноповязалка	С 150
Трубки BD Falcon 12 x 75 мм FACS	BD Biosciences	352008
Проточный цитометр BD LSR FORTESSA	BD Biosciences	ФОРТЕССА
центрифуга	Спинтрон	ГТ-175Р