$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Растворы и реагенты
- Полный RPMI
- Добавьте 56 мл фетальной телячьей сыворотки (FCS) и 5,5 мл 200 мМ L-глютамина во флакон среды RPMI-1640 объемом 500 мл.
- Решение DNase
- Приготовьте 1 мг ДНКазы/мл в DPBS.
- Буфер для окрашивания
- В ДПБС готовят 3% термоинактивированный ФТС и 0,09% азид натрия.
- Обратитесь к Списку материалов для определения фиксирующего буфера, буфера для пермеабилизации и буфера для промывки.
2. Окрашивание клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется поверхностное окрашивание клеток, выполните его перед фиксацией, убедившись, что клетки поддерживаются при температуре 4 °C на протяжении всего процесса.
- Ресуспендируйте клетки в 100 мкл окрашивающего буфера (для необязательного окрашивания поверхности добавьте рекомендуемый объем антитела к поверхностным антигенам и инкубируйте в течение 30 мин при 4 °C).
- Добавьте 1 мл буфера для окрашивания, центрифугируйте в течение 5 минут при 150 x g и выбросьте надосадочную жидкость.
заметка: Специфические антитела, концентрация, время инкубации и т. д. будут варьироваться в зависимости от конкретных экспериментальных целей.
- Фиксация и пермеабилизация
- Ресуспендировать клетки в 100 мкл фиксирующего буфера и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 1 мл промывочного буфера, центрифугируйте в течение 5 минут при 150 x g и выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клетки в 100 мкл буфера для пермеабилизации и инкубируйте клетки в течение 10 мин на льду.
- Добавьте 1 мл промывочного буфера, центрифугируйте в течение 5 минут при 150 x g и выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируют клетки в 100 мкл фиксирующего буфера на пробирку и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 1 мл промывочного буфера, центрифугируйте в течение 5 минут при 150 x g и выбросьте надосадочную жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости протокол можно приостановить здесь. Неподвижные элементы стабильны в течение нескольких дней при температуре 4 °C при ресуспендии в окрашивающем буфере. Перед тем, как продолжить, удалите буфер для окрашивания после центрифугирования.
- ДНКазное лечение
- Ресуспендируют клетки в 100 мкл раствора ДНКазы (30 мкг ДНКазы/106 клеток) и инкубируют клетки в течение 1 ч при 37 °С.
- Добавьте 1 мл промывочного буфера, центрифугируйте при 150 х г в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
- Окрашивание антителами
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание на внутриклеточные маркеры, отличные от BrdU, может быть выполнено одновременно с окрашиванием BrdU.
- ВАЖНО: Подготовьте компенсационный контроль, состоящий из неокрашенных клеток и клеток, помеченных каждым отдельным флуорохром. В идеале для контроля компенсации следует использовать те же антитела, что и в экспериментальных пробирках. Однако, если это невозможно, замените антитела на высокоэкспрессированные антигены, конъюгированные с тем же флуорохромом.
- Ресуспендируйте клетки в 50 мкл промывочного буфера и добавьте 1 мкл/106 клеток антитела BrdU.
Примечание: Также могут быть добавлены непосредственно конъюгированные антитела к другим специфическим внутриклеточным антигенам.
заметка: Антитела к гистону H3, фосфорилированному на Ser10, могут быть использованы для различения клеток в G2 и M, гистон H3 фосфорилируется на Ser10 во время митоза. Антитела к cdc2, фосфорилированные на Tyr15, могут быть использованы для обнаружения клеток, которые вступили в митоз.
- Инкубируйте клетки в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Добавьте 1 мл промывочного буфера, центрифугируйте ячейки при 150 х г в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
- Окрашивание ДНК для анализа клеточного цикла
- Разрыхлите гранулу и добавьте 20 μл раствора 7-AAD (0,25 μг).
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно использовать постоянное количество 7-AAD на ячейку.
- Ресуспендируйте клетки в 1 мл Окрашивающего буфера.