2D кокультура лейкозных клеток с BMSC: метод получения субпопуляций лейкозных клеток

Аннотация

Источник: Slone, W. L. et al. Моделирование резистентного к химиотерапии лейкоза in vitro. J. Vis. Exp. (2016).

Это видео описывает технику долгосрочного 2D-кокультивирования клеток лейкемии со стромальными клетками костного мозга для изучения их взаимодействия с микроокружением костного мозга. В 2D-модели кокультуры используются клетки острого лимфобластного лейкоза и стромальные или остеобласты костного мозга, которые влияют на фенотип опухолевых клеток. Это исследование будет способствовать изучению механизмов, лежащих в основе выживаемости лейкозных клеток при воздействии химиотерапии, поддерживаемой костным мозгом.

Протокол

1. Продвинутая подготовка

1. Культивирование стромальных клеток костного мозга (BMSC) и остеобластов (OB).
   1. Поддерживайте BMSC или OB при температуре 37 °C при 6%_CO2 и выращивайте на 10-сантиметровых планшетах для культуры тканей до достижения 90% конфлюенции.
   2. Трипсинизируйте клетки BMSC или OB и разделите 1:2 на новые пластины по 10 см. Клетки выращивают в соответствии с этими стандартами до тех пор, пока они не понадобятся для совместного культивирования лейкемии.

2. Создание и поддержание совместной культуры

1. Добавьте 5-20 x 10⁶ лейкозных клеток в 10 мл опухолеспецифичной питательной среды на 80%-90% сливающийся BMSC или OB-планшет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наша лаборатория поддерживает сокультуры при 37 °C в 5%_O2 для лучшего восстановления микроокружения костного мозга, которое, как было показано, колеблется от 1% до 7%. Тем не менее, поддержание сокультур при таком кислородном напряжении не имеет критического значения для создания трех лейкозных субпопуляций и остается на усмотрение лаборатории.
2. Каждые^4-й день удаляйте все среды, кроме 1 мл (включая лейкозные клетки в суспензии) и заменяйте 9 мл свежих лейкозных питательных сред. При удалении 9 мл среды из пластины будьте осторожны, чтобы не повредить стромальные клетки костного мозга (BMSC) или адгезивный слой остеобласта (OB).
   1. Извлеките среду, наклонив пластину в сторону, и аспирируйте среду в углу пластины. Кроме того, при добавлении свежего материала обязательно добавляйте по капле в угол пластины у боковой стенки, чтобы обеспечить минимальное разрушение адгезивного слоя BMSC или OB.
3. После^12-го дня совместного культивирования промойте лейкозные клетки из слоя BMSC или OB путем дозирования питательных сред из чашки вверх и вниз по чашке примерно 5-10 раз, а затем соберите в коническую пробирку объемом 15 мл. Пересейте на новую 80%-90% сливающуюся BMSC или OB пластину, как описано в шаге 2.1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожное промывание ко-культуры, как описано в шаге 2.3, удалит взвешенные и фазные светлые лейкозные клетки без нарушения монослоя BMSC или OB. Это позволяет переносить только опухолевые клетки на следующую кокультуральную пластину. Этот 12-дневный цикл можно повторять столько раз, сколько необходимо в зависимости от потребностей пользователя.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Чашки для клеточных культур 100 x 20 мм	Greiner Bio-One	664160 (Английский
Конические центрифужные пробирки 15 мл	Медицинские товары по всему миру	41021037	Используется для сбора клеток
Культурная среда
Остеобластные питательные среды	PromoCell	С-27001	Для сред остеобластов человека
Мультимедийное средство RPMI 1640	Медиатек, Инк.	15-040 (Английский	Для подготовки опухолевой среды
Адгезивные клетки
Остеобласты человека	PromoCell	С-12720	Остеобласты человека культивировали в соответствии с рекомендациями поставщика.
Стромальные клетки костного мозга человека	Ядро биообразца WVU		Обезличенные первичные лейкозы человека и стромальные клетки костного мозга (BMSC) были предоставлены Центром обработки биообразцов Онкологического центра Мэри Бэбб Рэндольф (MBRCC) и Банком тканей Департамента патологии Университета Западной Вирджинии
Лейкозные клетки
РЭ	АТКС	АТСС-CRL-8286	Культивирование клеток REH проводилось в соответствии с рекомендациями поставщика и рекомендованными средами.
СД-1	ДСМЗ	АСС 366	SD-1 культивировали в соответствии с рекомендациями поставщика и рекомендованными средами.

) )