Сбор лейкозных субпопуляций: метод пространственного разделения субпопуляций лейкемических клеток из 2D кокультуры

Abstract

Источник: Slone, W. L., et al. Моделирование резистентного к химиотерапии лейкоза in vitro. J. vis. Exp. (2016).

Это видео описывает метод пространственного разделения трех субпопуляций лейкозных клеток: взвешенных лейкозных клеток, свободно плавающих в среде, фазовых ярких лейкозных клеток, прилипших к поверхности монослоя мезенхимальных стромальных клеток, и фазовых тусклых лейкозных клеток, которые мигрировали под монослой мезенхимальных стромальных клеток из 2D ко-культуры.

Protocol

1. Разделение 3 субпопуляций в рамках Ко-культуры

1. Сбор субпопуляции суспензии (S) опухоли.
   1. Асасируйте среду из планшета для совместного культивирования с помощью пипетки и аккуратно повторно нанесите ту же среду, чтобы промыть планшет и собрать среду, содержащую лейкозные клетки, в коническую пробирку объемом 15 мл. Собранные лейкемические клетки представляют собой субпопуляцию S.
2. Сбор субпопуляции опухолей Phase Bright (PB).
   1. Добавьте 10 мл свежей среды обратно на тарелку для совместной культуры. Энергично промойте добавленную среду пипетированием вверх и вниз примерно 5 раз, чтобы удалить адгезивные лейкозные клетки, но не настолько сильно, чтобы вытеснить адгезивный компонент BMSC/OB.
   2. Отсадите с помощью пипетки и соберите среду в коническую пробирку объемом 15 мл. Собранные клетки представляют собой субпопуляцию PB.
3. Сбор субпопуляций опухолей Phase Dim (PD).
   1. Промойте пластину 1 мл PBS, чтобы удалить остатки среды. Трипсинизируйте планшет для совместной культуры 3 мл трипсина и поместите в инкубатор при температуре 37 °C на 5 минут.
   2. Извлеките планшет из инкубатора и осторожно постучите по боковым сторонам планшета, чтобы выбить прилипший BMSC/OB.
   3. Добавьте 1 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и пипеткой вверх и вниз 3-5 раз, чтобы разрушить крупные клеточные агрегаты.
   4. Соберите среды с клетками в коническую пробирку объемом 15 мл. Эти клетки также представляют собой неочищенную субпопуляцию БП с BMSC/OB.
4. Центрифугируйте 3 изолированные субпопуляции при 400 x g в течение 7 мин. Аспиратируйте и отбрасывайте надосадочную жидкость, а затем индивидуально ресуспендируйте гранулы в 1 мл предварительно подогретой среды. Ячейки готовы к загрузке на столбец G10.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Конические центрифужные пробирки 50 мл	Медицинские товары по всему миру	41021039	Консервирующий раствор для Цитологические препараты
Конические центрифужные пробирки 15 мл	Новацит	NA	Используется для сбора клеток
Фетальная бычья сыворотка	сигма	Ф6178
0,05% трипсин	Медиатек, Инк	5229 ТЭК 5	25-053-КИ
Чашки для клеточных культур 100 x 20 мм	Greiner Bio-One	664160 (Английский
Культурные медиа
Остеобластные питательные среды	PromoCell	С-27001	Для сред остеобластов человека
Мультимедийное средство RPMI 1640	Медиатек, Инк.	15-040 (Английский	Для подготовки опухолевой среды
Клеточные линии
Остеобласты человека	PromoCell	С-12720	Остеобласты человека культивировали в соответствии с рекомендациями поставщика.
Стромальные клетки костного мозга человека	Ядро биообразца WVU		Обезличенные первичные лейкозы человека и стромальные клетки костного мозга (BMSC) были предоставлены Центром обработки биообразцов Онкологического центра Мэри Бэбб Рэндольф (MBRCC) и Банком тканей Департамента патологии Университета Западной Вирджинии. Культуры BMSC были созданы в соответствии с описанным выше образом (*)
Лейкемические клетки
РЭ	АТКС	АТСС-CRL-8286	Культивирование клеток REH проводилось в соответствии с рекомендациями поставщика и рекомендованными средами.
СД-1	ДСМЗ	АСС 366	SD-1 культивировали в соответствии с рекомендациями поставщика и рекомендованными средами.