Сортировка клеток лейкоза на основе колонки G-10: метод очистки клеток острого лимфобластного лейкоза из стромальных клеток костного мозга

Abstract

Источник: Slone, W. L.,et al. Моделирование резистентного к химиотерапии лейкоза in vitro. J. vis. Exp. (2016).

В этом видео описывается отделение клеток острого лимфобластного лейкоза от стромальных клеток костного мозга с использованием колонок G-10 из десяти сшитых декстран гелевого типа. Этот метод помогает восстановить популяцию опухолевых клеток, которые мигрировали под адгезивные стромальные клетки костного мозга, образуя популяцию опухолевых клеток «фазового блеска».

Protocol

1. Загрузка кокультуральных клеток в столбец G10

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что запорный кран полностью закрыт, прежде чем добавлять ячейки среды в столбец G10. Кроме того, каждая субпопуляция должна быть пропущена по отдельному столбцу G10, чтобы не вносить никаких смещений между популяциями в нисходящем анализе.

1. С помощью пипетки объемом 1000 мкл добавьте по 1 мл каждой субпопуляции клеток в предварительно подогретой среде в отдельную колонку G10 по каплям. Убедитесь, что среда, содержащая элементы, остается сверху или внутри гранулы G10. Дайте клеткам инкубироваться на грануле G10 в течение 20 минут при RT.
   заметка: Запорный кран остается закрытым в течение всего периода инкубации.

2. Сбор лейкозных клеток из колонки G10

1. Добавьте 1-3 мл предварительно подогретого материала в каждую колонку G10. Откройте запорный кран и дайте среде медленно выйти из колонны по капле.
   заметка: Крайне важно поддерживать медленный расход из колонны, иначе гранулы G10, содержащие BMSC/OB, могут вымыться из колонны и загрязнить изолированные лейкозные клетки.
2. Продолжайте добавлять предварительно подогретую среду небольшими шагами (1-2 мл) в колонку G10, пока в общей сложности не пройдет через колонку и не будет собрано в общей сложности 15-20 мл. Закройте клапан запорного крана и трубку для сбора крышки.
   заметка: Если на дне сборной пробирки видна гранула частицы G10, аккуратно удалите среду из пробирки, оставив гранулу частицы G10 нетронутой, и переложите в новую пробирку.
3. Центрифугируйте собранную среду при давлении 400 x g в течение 7 мин при RT. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в буфере, подходящем для последующего применения.
4. В настоящее время клетки представляют собой чистую популяцию лейкозных клеток, не подверженных загрязнению BMSC или OB, и готовы к применению в последующих приложениях по усмотрению пользователя.
   Примечание: Жизнеспособность лейкозных клеток должна оставаться неизменной при прохождении клеток через колонки G10.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Бусины из сефадекса G10	сигма	Г10120	Упоминается в рукописи как гелевые сшитые декстранные частицы типа 10
10 мл стерильный шприц	БД	309604
1-ходовые запорные краны	Уорлд Прецизионные Инструменты, Инк.	14054-10
Остеобласты человека	PromoCell	С-12720	Остеобласты человека культивировали в соответствии с рекомендациями поставщика.
Стромальные клетки костного мозга человека	Ядро биообразца WVU		Обезличенные первичные лейкозы человека и стромальные клетки костного мозга (BMSC) были предоставлены Центром обработки биообразцов Онкологического центра Мэри Бэбб Рэндольф (MBRCC) и Банком тканей Департамента патологии Университета Западной Вирджинии. Культуры BMSC были созданы в соответствии с описанным выше образом (*)
0,05% трипсин	Медиатек, Инк.	25-053-КИ
РЭ	АТКС	АТСС-CRL-8286	Культивирование клеток REH проводилось в соответствии с рекомендациями поставщика и рекомендованными средами
Стекловата	пирекс	No 3950
Конические центрифужные пробирки 50 мл	Медицинские товары по всему миру	41021039	Используются в качестве пробирок для сбора
Конические центрифужные пробирки 15 мл	Медицинские товары по всему миру	41021037	Используется для сбора клеток
Фетальная бычья сыворотка	сигма	Ф6178
СД-1	ДСМЗ	АСС 366	SD-1 культивировали в соответствии с рекомендациями поставщика и рекомендованными средами
Чашки для клеточных культур 100 x 20 мм	Greiner Bio-One	664160 (Английский