Методическая статья

Ретроорбитальный забор крови: метод выделения мононуклеарных клеток из ретроорбитального синуса мыши

30 апреля 2023 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Mopin A. et al. Подробный протокол для характеристики мышиной клеточной линии C1498 и связанной с ней мышиной модели лейкемии. J. Vis. Exp. (2016)

В видео описывается метод забора забора периферической крови из ретроорбитального синуса мыши и дальнейшего выделения мононуклеарных клеток из крови с помощью центрифугирования градиента плотности.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ретро-орбитальный забор крови

  1. Проводите ретроорбитальный забор крови непосредственно перед эвтаназией в стерильных условиях в ламинарном колпаке и под нагревательной лампой для предотвращения переохлаждения.
  2. Для анестезии используют кетамин в дозе 150 мг/кг и ксилазин в дозе 10 мг/кг. Приготовьте обезболивающий раствор, разведя 1,5 мл кетамина и 0,5 мл ксилазина в 18 мл раствора PBS.
  3. Вставьте капиллярную трубку в медиальный кантус глаза. Кровь будет подниматься из орбитального синуса в капиллярную трубку. Остановите кровотечение, мягко надавливая на глаз стерильной марлевой губкой.
    заметка: С помощью этого метода можно собрать объем от 100 до 200 мкл крови.
  4. Соберите кровь в пробирку с ЭДТА и храните образец на льду перед выделением мононуклеарных клеток.

2. Выделение мононуклеарных клеток крови

  1. Переложите образец крови (от 100 до 200 мкл; получен на этапе 1.1) в микроцентрифужную пробирку и добавьте раствор PBS/1 мМ ЭДТА до тех пор, пока объем раствора не составит 500 мкл. Тщательно нанесите 500 мкл разделительного раствора под раствор, содержащий кровь, с помощью иглы 30G и шприца объемом 1 мл. Не смешивайте кровь и разделяющий раствор.
  2. Центрифугируйте пробирки при давлении 800 x g (без тормоза) в течение 20 минут при RT. После центрифугирования соберите клеточное кольцо (непрозрачный белый слой) с помощью пипетки. Перенесите ячейки в микроцентрифужную пробирку.
    заметка: Непрозрачный белый слой содержит лимфоциты, а также моноциты и появляется между нижним слоем – разделительным раствором – и верхним слоем.
  3. Добавьте 1 мл раствора PBS и центрифугируйте пробирку при 350 x g в течение 10 мин. Повторно суспендируйте клетки в 600 мкл буфера FACS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Кетамин 1000 (100 мг/мл) ВИРБАК 3.59713Э+12
Ксилазин СЕДАКСИЛАН (20 мг/мл) CEVA
Раствор PBS (1x концентрат) ThermoFisher Scientific 14190
Ultra Pure 0,5 М раствор ЭДТА, pH 8,0 ThermoFisher Scientific 15575
Сепарирующий раствор (Pancoll Mouse) ПАНБИОТЕХ П04-64100
Трубка ЭДТА Greiner Bio-One 454034
Пастеровская пипетка 150 мм (капиллярная трубка) Фишербранд 1154-6963 (Английский)
Пробирки проточной цитометрии (синие) Бекман Коултер 2523749
Микроцентрифужная пробирка (1,5 мл) ThermoFisher Scientific Тел.: 05-408-129
Стерильные марлевые губки УРГО 501580 (Английский
Игла 30 г Бектон и Дикинсон 304000 (Английский
1 мл шприц Терумо СС-01Т
Цитоцентрифуга Shandon Cytospin 3 ThermoFisher Scientific
) )

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PBSFACSC1498

Похожие статьи