$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Характеристика клеточной линии C1498 in vitro
- Культура клеток C1498 in vitro
- Приготовьте полную среду RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, добавив 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мл пенициллина (100 ЕД/мл)-стрептомицина (100 мкг/мл), 500 мкл 50 мМ β-меркаптоэтанола, 5 мл N-2-гидроксиэтилпиперазина-N-2-этана сульфоновой кислоты (HEPES), 5 мл заменимых аминокислот и 5 мл пирувата натрия к 500 мл среды RPMI.
- Выращивайте клеточную линию C1498 в полном объеме RPMI. Соберите клетки в суспензию с помощью пипетирования и перенесите клетки в пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте при 350 x g в течение 10 минут и удалите надосадочную жидкость.
- Добавьте 20 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) (1x), центрифугируйте при 350 x g в течение 10 минут и удалите надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клетки в 10 мл буфера Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACs) (2,5 г порошка бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 мл 0,5 М раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в 500 мл раствора PBS). Подсчитайте клетки с помощью камеры для подсчета клеток Thoma после окрашивания клеток трипановым синим.
2. Приготовление клеточной суспензии на предметных стеклах для микроскопии
- Промойте 106 из собранных клеток C1498 (полученных на шаге 1.1.4) 5 мл холодного буфера FACs дважды, и разведите клетки в 1 мл холодного буфера FACs. Поместите трубки на лед.
- Поместите предметные стекла в одноразовые камеры с предварительно прикрепленными фильтрующими картами и поместите их в цитоцентрифугу.
- Добавьте 100 μл буфера FAC в каждую камеру и фильтрующую карту и вращайте их в течение 2 минут при 4,52 x g.
- Добавьте по 100 мкл ячеек в каждую камеру и фильтрующую карту и вращайте элементы при давлении 4,52 x g в течение 2 минут.
- Осторожно извлеките предметные стекла из камер и высушите их на воздухе, прежде чем окрашивать их морилкой May-Grünwald Giemsa.
3. Окрашивание May-Grünwald Giemsa (MGG)
- Окрашивайте ячейки (приготовленные в разделе 2), погрузив предметные стекла в банку Coplin с раствором Май-Грюнвальда на 3 минуты.
- Переложите предметные стекла в банку Coplin, содержащую буферный раствор pH 6,8, на 1 минуту.
- Испачкайте предметные стекла, поместив их в банку Coplin, содержащую раствор Giemsa R (разбавленный до 1/20 в буферном растворе pH 6,8) на 10 минут. Промойте предметные стекла нейтральной водой (pH 7) в течение 10 секунд.
- Слейте воду и высушите слайды на воздухе. Установите предметные стекла, нанеся на элементы одну каплю монтажного носителя 2. Поместите один край покровного стекла на предметное стекло и осторожно опустите его на ячейки с помощью щипцов. Осторожно надавите на защитное стекло, чтобы удалить пузырьки воздуха.