Центрифугирование с градиентом плотности: метод выделения клеток ХЛЛ из периферической крови

Abstract

Источник: Hay, J. et al. Субклеточное фракционирование клеток первичного хронического лимфоцитарного лейкоза для мониторинга трафика ядерных/цитоплазматических белков. J. vis. Exp. (2019).

Это видео описывает технику выделения клеток хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) из периферической крови. С помощью этого протокола мы будем выделять клетки ХЛЛ из образца крови пациента для последующей эффективной генерации ядерных и цитоплазматических фракций.

Protocol

1. Выделение клеток ХЛЛ из образцов крови пациента

1. Образцы периферической крови пациентов с ранее полученным согласием на ХЛЛ поступают из клиники в пробирках для сбора крови ЭДТА, сопровождаемые подсчетом лейкоцитов (WCC). Очистите образцы ХЛЛ периферической крови в соответствии с ВСЦ. Для WCC < 40 x 10⁶ клеток/мл перейдите к шагу 1.1.1; для WCC ≥ 40 x 10⁶ клеток/мл перейдите к шагу 1.1.2.
   1. Вылейте содержимое всех пробирок с кровью ЭДТА в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл и добавьте 50 мкл коктейля для обогащения В-клеток человека на 1 мл крови. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 20 минут. Перейдите к шагу 1.1.2.
   2. Разбавьте образец в соотношении 1:1 с помощью промывочного буфера RT CLL (фосфатно-солевой буфер (PBS), 0,5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и 2 мМ ЭДТА).
2. Добавьте градиентную среду RT в коническую центрифужную пробирку соответствующего размера для образца (10 мл в пробирку объемом 50 мл для 30 мл образца или 4 мл в пробирку объемом 15 мл для 10 мл образца).
3. Тщательно нанесите слой образца поверх среды с градиентом плотности и центрифугируйте при давлении 400 x g в течение 30 минут при RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что центрифуга находится в режиме RT, прежде чем образцы будут помещены в центрифугу, так как изменение температуры приведет к плохому обогащению мононуклеарных элементов, и выключите тормоз на центрифуге, так как резкое торможение может нарушить жидкую границу раздела.
4. Аккуратно соберите белый слой мононуклеарных ячеек, которые собираются на границе градиентной среды плотности и буфера для промывки ХЛЛ, в свежую коническую пробирку центрифуги объемом 50 мл с помощью пластиковой пипетки Пастера.
5. Добавьте 40 мл промывочного буфера ХЛЛ к изолированному монослою для промывки клеток и центрифугируйте при 300 x g в течение 10 минут при RT.
6. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу, щелкнув дном трубки, затем повторите этап промывки, описанный в шаге 1.5.
7. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу, как описано в шаге 1.6, затем повторно суспендируйте гранулу в установленном объеме буфера для промывки ХЛЛ (до 40 мл, в зависимости от размера клеточной гранулы).
8. Посчитайте клетки с помощью трипанового синего и гемоцитометра. Затем приступают к проточной цитометрии, чтобы проверить чистоту клеток ХЛЛ.
   Примечание: На этой стадии клетки ХЛЛ могут быть культивированы в концентрации 10 x 10⁶ клеток/мл в среде для использования в экспериментах и/или криоконсервированы в 10% диметилсульфоксиде (ДМСО)/FBS для будущей работы в концентрациях до 100 x 10⁶ клеток/флакон
.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Тюбик 15 мл	Griener Bio one	188271
Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл	Griener Bio one	616201
Дмсо	сигма	Д2650
Эдта	сигма	ЭЦП
Фетальная бычья сыворотка	Термофишер	10500064
Среда с градиентом плотности Histopaque1077	сигма	Н8889
Решение Trypan Blue	Термофишер	15250061
Таблетки PBS	Научный центр Фишера	BR0014G
RosetteSep Коктейль для обогащения В-клеток человека	Технологии стволовых клеток	15064
Сигма 3-16П	SciQuip		центрифуга