$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Получение субклеточных фракций из клеток ХЛЛ
ПРИМЕЧАНИЕ: При планировании экспериментальной установки включите лунку с нестимулированными/необработанными клетками, из которых можно получить весь клеточный экстракт.
- Проведите желаемую стимуляцию и/или медикаментозное лечение клеточной линии MEC1 ХЛЛ или выделенных первичных клеток ХЛЛ, используя 10 – 20 x 106 клеток/условие. Затем клетки будут использоваться для субклеточного фракционирования или для получения экстракта цельных клеток, как описано ниже:
- Приготовление растворов/пробирок: Приготовьте все растворы/буферы свежими в день фракционирования перед сбором клеток. Храните растворы на льду до тех пор, пока они не понадобятся, и используйте в течение 4 часов после приготовления.
- Раствор ингибитора фосфатазы: Приготовьте ингибиторы фосфатазы в PBS, разбавив ингибиторы фосфатазы в соотношении 1:20 в 1x PBS (т.е. 0,5 мл ингибиторов фосфатазы в 9,5 мл в 1x PBS).
заметка: Убедитесь, что ингибиторы фосфатазы не выпали в осадок. Если присутствует осадок, нагрейте до 50 °C в течение 10 минут.
- Гипотонический буфер: Приготовьте 1x гипотонический буфер, разбавив 1:10 10x гипотонического буфера в дистиллированной воде (т.е. 50 мкл 10x гипотонического буфера до 450 μ л dH2O).
- 10 мМ дитиотреитол (DTT): Приготовьте 10 мМ DTT путем разбавления 1М DTT в соотношении 1:100 с дистиллированной водой (т.е. 10 мкл 1 М DTT в 990 мкл dH2O).
заметка: DTT очень лабилен, поэтому каждый раз готовьте его свежим. Избегайте повторных циклов замораживания/размораживания.
- Буфер для полного лизиса: Определите, сколько буфера требуется для каждого эксперимента. Для каждого образца требуется 50 мкл буфера для полного лизиса, поэтому добавьте 5 мкл 10 мМ DTT к 44,5 мкл буфера для лизиса, а затем добавьте 0,5 мкл коктейля ингибиторов протеазы. Это количество может быть увеличено в зависимости от количества образцов в эксперименте.
- Пометьте четыре комплекта микропробирок объемом 1,5 мл для каждой стимуляции и/или медикаментозного лечения свежестимулированных клеток, свежесгенерированных цитоплазматических фракций, свежесгенерированных ядерных фракций и лизатов целых клеток. Предварительно охладите эти микропробирки на льду до тех пор, пока они не потребуются.
- Перенесите клетки в индивидуально помеченные пробирки с микрофугой объемом 1,5 мл и гранулы путем центрифугирования при 200 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 1 мл ледяных ингибиторов PBS/фосфатазы. Гранулируйте клетки центрифугированием при 200 x g в течение 5 минут при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и держите гранулы клеток на льду.
- Приготовление цитоплазматических фракций: Мягко ресуспендировать клеточные гранулы, которые будут использоваться для субклеточного фракционирования, в 50 мкл 1x гипотонического буфера. Инкубируйте клетки на льду в течение 15 минут, чтобы они могли набухнуть.
заметка: Объем используемого гипотонического буфера может быть увеличен опытным путем в зависимости от количества клеток.
- Добавьте 0,8 - 2,5 мкл (от 1:20 до 1:60) моющего средства в каждый образец и перемешайте на максимальной настройке в течение 10 секунд.
- Чтобы определить оптимальную концентрацию детергента для использования для конкретного типа клеток для выделения ядерной и цитоплазматической фракций, сначала выполните градиент детергента. Диапазон от 1:20 до 1:60 (т.е. от 2,5 мкл до 0,8 мкл моющего средства на 50 мкл гипотонического буфера) должен быть достаточным.
заметка: Если объем гипотонического буфера на шаге 3.4 регулируется, убедитесь, что поддерживается соответствующее соотношение моющих средств.
- Проверьте лизис клеток, наблюдая за клетками с помощью фазово-контрастного микроскопа до и после добавления моющего средства. Целые клетки кажутся более крупными с плотным темным ядром. Цитоплазма будет выглядеть как яркое гало вокруг ядра.
заметка: Надлежащий лизис дополнительно подтверждается использованием вестерн-блоттинга для анализа специфических белков в лизированных фракциях, полученных из градиента детергента.
- После лизиса образцы центрифугируют при давлении 14 000 x g в течение 30 с при 4 °C.
- Осторожно переложите надосадочную жидкость в предварительно охлажденную пробирку с маркировкой для микрофугов. Эта цитоплазматическая фракция может храниться при температуре -80 °C до тех пор, пока она не потребуется для дальнейшего анализа. Оставшаяся гранула содержит ядерную фракцию.
заметка: Избегайте повторных циклов замораживания/размораживания образцов.
- Приготовление ядерных фракций: Ресуспендирование каждой ядерной гранулы в 50 мкл буфера для полного лизиса путем пипетирования вверх и вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера для полного лизиса может быть отрегулирован опытным путем в соответствии с исходным номером ячейки.
- Добавьте 2,5 мкл детергента для растворения белков, связанных с ядерной мембраной и вихрем, на максимальной настройке в течение 10 с. Инкубируйте образцы на льду в течение 30 мин.
- Ввергните в вихревой режим на максимальную настройку в течение 30 с, затем центрифугируйте образцы при 14 000 x g в течение 20 мин при 4 °C.
- Переложите надосадочную жидкость в предварительно охлажденную пробирку с маркировкой для микрофугов. Эта ядерная фракция может храниться при температуре -80 °C до тех пор, пока она не потребуется для дальнейшего анализа.
заметка: Избегайте повторных циклов замораживания/размораживания образцов.