Анализ внеклеточного потока: метод измерения метаболического профиля клеток

Аннотация

Источник: Хлозкова К. и др. Оценка метаболического профиля клеток первичного лейкоза. J. Vis. Exp. (2018).

Этот протокол обеспечивает биохимический подход к измерению скорости внеклеточного закисления (ECAR) и скорости потребления кислорода (OCR) первичных лейкозных клеток с помощью анализа внеклеточного потока. Оценка метаболического профиля этих клеток помогает охарактеризовать их потребности, что приводит к персонализированной терапии.

Протокол

1. Приготовление реагентов

1. Приготовьте 500 мл PBS путем растворения 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na₂HPO₄, 1,47 мМ KH₂PO₄, в ddH₂O. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью HCl. Стерилизуйте автоклавированием.
2. Приготовьте 100 мл среды RPMI: среду RPMI-1640 с L-аланил-глутамином с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл).
3. Приготовьте 50 мл 0,1 М NaHCO₃ в дистиллированной воде. Отрегулируйте pH до 8,1, простерилизуйте фильтр (0,22 мкм) и храните при температуре 4 °C.<бр/> заметка: Для двух 8-луночных планшетов для внеклеточного анализатора потока приготовьте 250 мкл 0,1 М NaHCO₃ pH 8,1.
4. Приготовьте 1 мл 2 М D-глюкозы в дистиллированной воде. Фильтр простерилизовать (0,22 мкм) и хранить при температуре -20 °C.
5. Приготовьте 100 мкл 1 мМ олигомицина А в этаноле. Фильтр простерилизовать (0,22 мкм) и хранить при температуре -20 °C.
6. Приготовьте 250 мкл 1 М 2-дезокси-D-глюкозы (2-DG) в минимальном DMEM (модифицированная орлиная среда Дульбекко). Нагрейте до 37 °C и отрегулируйте pH до 7,4 (проведите измерение pH при 37 °C). Фильтр простерилизовать (0,22 мкм) и хранить при температуре -20 °C.
7. Приготовьте 100 мкл 1 мМ FCCP (карбонильцианид--трифторметоксифенилгидразона) в ДМСО. Фильтр простерилизовать (0,22 мкм) и хранить при температуре -20 °C.
8. Приготовьте 100 мкл 1 мМ ротенона в этаноле. Фильтр простерилизовать (0,22 мкм) и хранить при температуре -20 °C.
9. Приготовьте 100 мкл 1 мг/мл антимицина А в этаноле. Фильтр простерилизовать (0,22 мкм) и хранить при температуре -20 °C.
10. Непосредственно перед применением приготовьте 10 мл среды для стресс-тестов гликолиза. Нагрейте Minimal DMEM до 37 °C на водяной бане и отрегулируйте pH до 7,4 (проведите измерение pH при 37 °C).
11. Перед применением приготовьте 10 мл среды для стресс-тестов Cell Mito с BSA. Добавка Minimal DMEM с 2 мМ L-глутамина, 10 мМ D-глюкозы, 1 мМ HEPES (pH 7,4), 1 мМ пирувата и 0,1 % BSA (бычьего сывороточного альбумина). Нагрейте до 37 °C на водяной бане и отрегулируйте pH до 7,4 (проведите измерение pH при 37 °C).
12. Перед применением приготовьте 10 мл среды для стресс-тестов Cell Mito без BSA. Дополните Minimum DMEM 2 мМ L-глутамином, 10 мМ D-глюкозой, 1 мМ HEPES (pH 7,4) и 1 мМ пируватом. Тепло Cell Mito протестируйте нагрузочную среду без BSA до 37 °C на водяной бане и отрегулируйте pH до 7,4 (проведите измерение pH при 37 °C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: БСА добавляют в среду для стресс-тестов Cell Mito, потому что клетки лучше реагируют на FCCP при добавлении среды с БСА (были протестированы другие условия). Для загрузки портов используется среда для стресс-тестов Cell Mito без BSA, так как производитель не рекомендует использовать BSA в среде.

2. Культивирование мононуклеарных клеток за ночь

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все подшаги в капюшоне для культуры стерильных тканей.

1. Приготовьте две колбы T75 с 20 мл RPMI. В каждую колбу добавьте 30 х 10⁶ изолированных мононуклеарных ячеек. Инкубируйте клетки в колбе в течение 16–24 ч при 5%_CO2 и 37 °C.

3. Подготовка пластин с клеевым покрытием

1. Покрыть две 8-луночные пластины для анализатора внеклеточного потока.
   заметка: Выполняют нанесение покрытия в стерильном вытяжном помещении для культуры тканей.
2. Добавьте 2,2 мкл клеточного клеточного клея (плотность: 2,54 мг/мл) к 250 мкл 0,1 М NaHCO₃, pH 8,1 и немедленно пипетируйте 12,5 мкл раствора в каждую лунку><. заметка: Клеевые материалы для ячеек могут различаться по своей плотности, соответственно регулируйте объем, добавляемый в NaHCO₃.
3. Дайте пластинам постоять в колпаке около 20 минут, затем аспирируйте клеточный клей и дважды промойте каждую лунку, используя 200 μл стерильной воды. Оставьте его в вытяжке с открытой крышкой, пока лунки не высохнут.
4. Используйте пластины сразу или сэкономьте до 1 недели при температуре 4 °C, обернув ободок парафиновой пленкой, чтобы избежать конденсации. Следите за тем, чтобы пластины прогревались до комнатной температуры (около 20 мин) в вытяжке перед посевом ячеек.

4. Гидратация сенсорного картриджа

ПРИМЕЧАНИЕ: Увлажните два 8-луночных картриджа анализатора внеклеточного потока.

1. Отделите коммунальную пластину и картридж датчика. Положите картридж датчика вверх дном на лабораторный стол.
2. Заполните каждую лунку коммунальной пластины калибром 200 μL. Заполните каждый ров вокруг внешней стороны лунок 400 мкл калибра.
3. Верните картридж датчика на рабочую пластину, в которой теперь находится калибр.
4. Поместите картридж в сборе во увлажненный инкубатор без CO₂, 37 °C на ночь.
5. Включите анализатор внеклеточного потока и дайте ему нагреться до 37 °C на ночь.

5. Затравка ячеек в пластинах с клеевым покрытием

ПРИМЕЧАНИЕ: Для стресс-теста гликолиза используйте среду для стресс-теста гликолиза. Для стресс-теста Cell Mito используйте среду для стресс-тестов Cell Mito с BSA.

1. Затравочные клетки для стресс-теста на гликолиз и стресс-теста Cell Mito в отдельных планшетах. Для каждого теста используйте клетки из одной колбы с ночным посевом.
2. Центрифугируйте ячейки при плотности 200 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Суспензируйте клетки в 1 мл соответствующей среды и подсчитайте их.
3. Добавьте 4 x 10⁶ живых клеток до конечного объема 400 μл (используйте соответствующую среду).
4. Пластину 50 мкл клеточной суспензии в лунки B-G. Убедитесь, что 500 000 клеток засеяны в одну лунку.
   заметка: Очень важно засеять ровно 500 000 клеток в лунку, так как никакой другой нормализации не проводится. Таким образом, можно сравнить результаты разных пациентов. Оптимальное количество повторов — шесть, как описано здесь. Использование меньшего количества репликаций не рекомендуется, так как первичные клетки иногда могут вести себя ошибочно.
5. Добавьте 180 мкл соответствующей среды в лунки А и Н (эти лунки будут служить коррекцией фона).
6. Центрифугируйте пластину при давлении 400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре при выключенном тормозе на 1.
7. Медленно и осторожно добавляйте 130 мкл соответствующей среды в лунки B-G в две 8-луночные планшеты для анализатора внеклеточного потока. Визуально убедиться в том, что ячейки устойчиво прилегают к дну лунок, можно путем просмотра под микроскопом.
8. Поместите планшет во увлажненный инкубатор без CO₂, 37 °C на 30 минут.

6. Загрузка картриджа датчика

1. Для стресс-теста гликолиза приготовьте по 250 мкл по 100 мМ глюкозы, 20 мкМ олигомицина А и 1 М 2-DG, все в среде для нагрузочных испытаний гликолиза.
2. Для стресс-теста Cell Mito приготовьте по 250 мкл 20 мкМ олигомицина А, 15 мкМ FCCP, 30 мкМ FCCP и смесь 10 мкМ ротенона и 10 мкг/мл антимицина А, все в среде для стресс-тестов Cell Mito без BSA.
   заметка: Рекомендуется вводить две концентрации FCCP в одном анализе, поскольку материала для титрования FCCP недостаточно у пациентов. Тем не менее, концентрации должны быть определены исследователем.
3. Загрузите компаунды в соответствующие отверстия инжектора картриджа следующим образом (Таблица 1):

7. Настройка программы

1. Для стресс-теста на гликолиз настройте программу, как описано в таблице 2.
2. Для стресс-теста Cell Mito настройте программу, как описано в таблице 3.
3. Запустите программу. Замените пластину калибра на пластину для анализа (при появлении запроса).

порт	Стресс-тест на гликолиз		Стресс-тест Cell mito
	Груз в порт	Окончательное концентрирование в скважинах	Груз в порт	Окончательное концентрирование в скважинах
a	20 мкл 100 мМ глюкозы	10 мМ глюкозы	20 мкл 20 мкМ олигомицина А	2 мкМ олигомицина А
В	22 мкл 20 мкМ олигомицина А	2 мкМ олигомицина А	22 мкл 15 мкМ FCCP	1,5 мкМ FCCP
С	25 мкл 1 М 2-DG	100 мМ 2-ДГ	25 мкл 30 мкМ FCCP	4,5 мкМ FCCP
Г	Х		25 мкл 10 мкМ ротенона и 10 мкг/мл антимицина А	1 μМ Ротенон и 1 μг/мл Антимицин А

Таблица 1: Составные объемы.

шаг	Параметры
калибровка	Автоматически
равновесие	Автоматически
Базовое измерение	Три раза: Смешивание – 3 мин, Ожидание – 0 мин, Мера – 3 мин
Впрыск порта А	инъекция
измерение	Три раза: Смешивание – 3 мин, Ожидание – 0 мин, Мера – 3 мин
Впрыск порта B	инъекция
измерение	Три раза: Смешивание – 3 мин, Ожидание – 0 мин, Мера – 3 мин
Впрыск порта C	инъекция
измерение	Четыре раза: Смешивание – 3 мин, Ожидание – 0 мин, Измерение – 3 мин

Таблица 2: Программа стресс-теста на гликолиз.

шаг	Параметры
калибровка	Автоматически
равновесие	Автоматически
Базовое измерение	Три раза: Смешивание – 3 мин, Ожидание – 0 мин, Мера – 3 мин
Впрыск порта А	инъекция
измерение	Три раза: Смешивание – 3 мин, Ожидание – 0 мин, Мера – 3 мин
Впрыск порта B	инъекция
измерение	Три раза: Смешивание – 3 мин, Ожидание – 0 мин, Мера – 3 мин
Впрыск порта C	инъекция
измерение	Три раза: Смешивание – 3 мин, Ожидание – 0 мин, Мера – 3 мин
Впрыск порта D	инъекция
измерение	Три раза: Смешивание – 3 мин, Ожидание – 0 мин, Мера – 3 мин

Таблица 3: Программа стресс-теста Cell Mito.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Анализатор морских коньков XFp	Agilent Technologies	С7802А
Минипланшет для клеточной культуры Seahorse XFp	Agilent Technologies	103025-100
Клеточный и тканевый клей Corning™ Cell-Tak	ThermoFisher Scientific	CB40240
D-(+) Глюкоза	Сигма-Олдрич	Г7021-100Г
Олигомицин А	Сигма-Олдрич	75351-5МГ
2-дезокси-D-глюкоза	Сигма-Олдрич	Д8375-1Г
ФКХП	Сигма-Олдрич	С2920-10МГ
Ротенон	Сигма-Олдрич	Р8875-1Г
Антимицин А из Streptomyces sp.	Сигма-Олдрич	А8674-25МГ
Seahorse XF базовый средний, 100 мл	Agilent Technologies	103193-100
L-раствор глютамина, 200 мМ	Сигма-Олдрич	G7513-100МЛ