Обогащение Т-клеток: метод выделения Т-клеток из смешанной популяции клеток с помощью магнитной сепарации

Аннотация

Источник: Nguyen, H. D., et al. Платформа для трансплантации костного мозга для исследования роли дендритных клеток при реакции "трансплантат против хозяина". J. Vis. Exp. (2020).

В этом видео описывается обогащение Т-клеток из селезенки мыши путем отрицательного отбора с помощью магнитного сепаратора. Метод включает в себя нацеливание на другие клетки в образце для истощения с помощью антител или лигандов, направленных против специфических антигенов клеточной поверхности.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. День 1: Подготовка Т-клеток от мышей-доноров

1. Используйте мышей CD45.2⁺ H2k^b+ C57BL/6 дикого типа (WT) в качестве доноров для Т-клеток.
2. Усыпьте мышей C57BL/6 путем удушения углекислым газом (CO₂) и подождите 2−3 минуты, пока они не потеряют сознание. При необходимости выполните вывих шейки матки в качестве вторичной эвтаназии.
3. Тщательно очистите шерсть и кожу мыши 70% этанолом. Иссекают селезенку и лимфатические узлы и разделяют их в одноклеточную суспензию спленоцитов с помощью поршня шприца и сетчатых фильтров 40 мкм. Промойте фильтр и поршень шприца 1% RPMI (1% FBS, содержащий среду RPMI), чтобы собрать все спленоциты.
4. Центрифугируйте клеточную суспензию при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C. Добавьте 5 мл лизирующего буфера ACK (1 mM Na₂EDTA, 10 mM KHCO₃, 144 mM NH₄Cl, pH 7,2) после удаления надосадочной жидкости. Инкубировать клеточную суспензию в течение 5 мин при комнатной температуре.
   заметка: Буфер для лизиса ACK используется для лизирования эритроцитов.
5. Добавьте 5 мл 1% RPMI, чтобы остановить лизис. Центрифугируйте при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
6. Приготовьте ледяной буфер для сортировки магнитных клеток (MACS) (0,5% BSA, 2 mM EDTA в PBS, pH 7,2). Перед использованием буфер дегазирует. Ресуспендируйте клеточные гранулы в 5 мл буфера MACS.
7. Подсчитайте количество спленоцитов и проверьте наличие живых и мертвых клеток с помощью гемоцитометра и 1% трипанового синего. Сохраните аликвоту 2 x 10⁶ клеток для оценки выхода очистки с помощью анализа проточной цитометрии.
8. Ресуспендировать спленоциты в концентрации 200 x 10⁶/мл в буфере MACS. Добавьте 0,03 мкл биотина анти-мыши-Ter-119, 0,03 мкл биотина анти-мышиного CD11b, 0,03 мкл биотина антимышиного -CD45R и 0,03 мкл биотина антимышиного -DX5 на 10⁶ клеток. Инкубировать в течение 15 мин при 4 °C.
   заметка: Биотин против мыши-Ter-119, биотин анти-мышиный-CD11b, биотин-антимышиный-CD45R и биотин-анти-мышиный-DX5 использовали для реакции с эритроидами, гранулоцитами, В-клетками и NK-клетками соответственно. Таким образом, эти подмножества ячеек исчерпываются на следующем этапе.
9. Добавьте в клеточную суспензию 10 мл ледяного буфера MACS. Центрифугируйте при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
10. Ресуспендируйте клеточные гранулы в буфере MACS в концентрации 100 x 10⁶/мл. Добавьте в суспензию спленоцитов микрогранулы, антибиотин (0,22 μл/10⁶ клеток). Хорошо перемешайте и инкубируйте еще 15 минут при 4 °C. Промойте клеточную суспензию один раз 10 мл ледяного буфера MACS. Центрифугируйте при 800 x g в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
11. Поместите магнитную разделительную колонку в магнитное поле. Промойте колонку 3 мл буфера MACS. Опустите клеточную суспензию на колонку. Соберите проточные трубки, состоящие из несвязанных, обогащенных Т-клеток, в новую коническую пробирку объемом 15 мл. Промойте колонку MS 3 мл ледяного буфера MACS.
    заметка: Перед выполнением этапов промывки убедитесь, что колонка пуста.
12. Центрифугируйте клеточную суспензию при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 5 мл буфера MACS.
13. Посчитайте клетки в 1% трипановом синем с помощью гемоцитометра. Сохраните аликвоту 2 x 10⁶ клеток для проверки чистоты с помощью проточной цитометрии.
    заметка: Средний выход выделенных этим методом Т-клеток селезенки составляет ~20−25 х 10⁶ клеток на одну мышь.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
РПМИ 1640	Thermo Fisher Scienctific	11875-093	медиа
MidiMACS	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-042-302	Обогащение Т-клетками
0,5 м ЭДТА pH 8,0 100 МЛ	Научный центр Фишера	BP2482100	Буфер MACS
10-кратный PBS	Научный центр Фишера	БП3994	Буфер MACS
Антибиотиновые микрошарики	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-090-485	Обогащение Т-клетками
Античеловек/мышь CD45R (B220)	Thermo Fisher Scientific	13-0452-85 (Английский	Обогащение Т-клетками
Антимышиный CD4 биотин	Thermo Fisher Scientific	Тел.: 13-0041-86	Обогащение Т-клетками
CD11b	Thermo Fisher Scientific	Тел.: 13-0112-85	Обогащение Т-клетками
CD25-биотин	Thermo Fisher Scientific	Тел.: 13-0251-82	Обогащение Т-клетками
КД45Р	Thermo Fisher Scientific	Тел.: 13-0452-82	Обогащение Т-клетками
CD49b моноклональное антитело (DX5)-биотин	Thermo Fisher Scientific	13-5971-82	Обогащение Т-клетками
Антимышиный TER-119 биотин	Thermo Fisher Scientific	Тел.: 13-5921-85	Обогащение Т-клетками
Антимышь CD45.1 PE	Thermo Fisher Scientific	Тел.: 12-0900-83	Анализ проточной цитометрии
C57BL/6 мышей	Чарльз Ривер	27	Доноры/реципиенты
Пробирки для проточной цитометрии	Научный центр Фишера	352008	Анализ проточной цитометрии
Сетчатый фильтр для ячеек 40 мкМ	Thermo Fisher Scientific	22363547	Подготовка клеток

)