$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Создание дендритных клеток, полученных из костного мозга (BM-DCs).
- Выделите костный мозг из бедренных и большеберцовых костей мышей с WT или фактором B (fB)-/- на фоне B6. Кратко соберите большеберцовую и бедренную кости с обеих ног с помощью щипцов и ножниц. Поместите их в ледяные RPMI, содержащие 1% FCS и 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина и 2 мМ L-глутамина (1% RPMI) в конические пробирки объемом 50 мл. Тщательно очистите бедренную и большеберцовую кости, удалив все мышечные ткани с помощью щипцов и ножниц. Перенесите бедренную и большеберцовую кости из конических трубок объемом 50 мл в чашку Петри диаметром 92 мм, содержащую 1% RPMI. С помощью ножниц разрежьте концы бедренной кости или большеберцовой кости. Наполните пробирку объемом 50 мл 25 мл 1% среды RPMI 1640. Используйте его для наполнения шприца объемом 3 мл, прикрепленного к игле 26 G, 3 мл 1% RPMI. Вставьте этот шприц в кость и нажмите на поршень, чтобы вымыть костный мозг (БМ) из полости в пробирку для сбора с 1% RPMI (~3 мл/кость). Вращайте ячейки при 800 x g в течение 5 минут.
- Ресуспендируйте гранулу в 5 мл лизирующего буфера ACK для лизиса эритроцитов. Инкубируйте клеточную суспензию в течение 5 мин на льду. Добавьте 10 мл 1% RPMI в клеточную суспензию, чтобы остановить лизис, и центрифугируйте при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клеточные гранулы в 10 мл питательной среды (RPMI 1640, содержащей 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина, 2 мМ l-глутамина и 50 мМ β-меркаптоэтанола) и отрегулируйте объем до достижения конечной концентрации 2 x 106 клеток/мл.
- Добавьте в клеточную суспензию 20 нг/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF). Культивируют клетки костного мозга в чашках Петри размером 100 x 15 мм при 37 °C и 5%CO2 в течение 6 дней.
- Замените половину текущей питательной среды (около 5 мл) свежей средой, содержащей 40 нг/мл GM-CSF на 3-й день.
- Предварительно подогрейте питательную среду на водяной бане при 37 °С. Соберите около 5 мл среды из посуды для культивирования костного мозга. Центрифугируйте при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 5 мл питательной среды, содержащей 40 нг/мл GM-CSF.
- Добавьте 25 мкг/мл липополисахарида (ЛПС) в среду на 6-й день культивирования для созревания ДК-ДК. Сохраните аликвоту 2 х10 6 клеток для определения эффективности дифференцировки ДК с помощью проточной цитометрии.
- Собирайте созревшие BM-DC: Используйте клеточные подъемники, чтобы мягко соскрести DC с чашек Петри. Соберите все клеточные суспензии в конические пробирки объемом 50 мл. Центрифугируйте при 800 x g, в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость. Промойте гранулы ячейки 3 раза 50 мл ледяного PBS. Сохраните около 2 x 106 BM-DC для иммунологического анализа фенотипа методом проточной цитометрии.