Сдвиг хроматина: метод получения фрагментов хроматина с помощью ферментативного расщепления

Аннотация

Источник: Fuchs, A. R. et al. A Анализ иммунопреципитации хроматина для идентификации новых генов-мишеней NFAT2 при хроническом лимфоцитарном лейкозе. J. Vis. Exp.(2018).

Это видео описывает протокол сдвига хроматина с использованием ферментативного расщепления микрококковой нуклеазы. Сдвиг хроматина является важным этапом в процессе иммунопреципитации хроматина или ChIp, который помогает исследовать взаимодействие белка и ДНК в клетках хронического миелоидного лейкоза человека. В протоколе функции сдвиг хроматина выполняется с помощью ультразвуковой обработки.

Протокол

1. Фиксация, лизис клеток и сдвиг хроматина

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы пациентов и клетки Jurkat фиксируются и лизируются с помощью коммерчески доступного набора ChIP в соответствии с инструкциями производителя с модификациями, как описано ранее. Фиксация проводится под ламинарным проточным колпаком.

1. Приготовьте пробирку объемом 1,5 мл с 1 мл 37% формальдегида, пробирку объемом 1,5 мл с 1 мл 1,25 М глицина, пробирку объемом 5 мл с 4 мл 1x PBS и коробку со льдом для фиксации клеток.
2. После стимуляции клеток в течение соответствующего времени инкубации стимулируйте клетки путем добавления 32,4 нМ форбола 12-миристат 13-ацетата (PMA) и 1 μМ иономицина. Затем инкубируют клетки в течение 16 ч при 37 °C и 5%_CO2 при открытой крышке пробирки (во избежание загрязнения можно использовать герметизирующую пленку, проницаемую для воздуха, вращают пробирки объемом 5 мл при температуре 200 x g в течение 5 мин и повторно суспендируют клетки в 500 мкл PBS в пробирках объемом 5 мл.
3. Добавьте в клетки 340 мкМ формальдегида (13,5 мкл 37% формальдегида). После краткого перемешивания путем тщательного пипетирования вверх и вниз инкубировать суспензию в течение 2,5 мин (клетки Джурката) или 5 мин (образец пациента) при комнатной температуре.
   заметка: Для обеспечения оптимального сдвига первичным клеткам требуется более длительное время фиксации.
4. Добавьте 125 мМ глицина (57 мкл 1,25 М глицина), чтобы остановить фиксацию, и инкубируйте еще 5 мин. Сразу после этого поместите клетки на лед и центрифугируйте при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость с помощью аспирации.
5. Дважды промойте камеры 1 мл ледяного PBS при температуре 200 x g в течение 5 минут при 4 °C и каждый раз удаляйте надосадочную жидкость путем аспирации><. заметка: После фиксации протокол может быть приостановлен. Стационарные элементы должны храниться при температуре -80 °C. Для тестирования, если эпитоп антитела, предназначенного для использования в следующем протоколе, не замаскирован с помощью фиксации, можно использовать дополнительные образцы для анализа с помощью гель-электрофореза SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Эти этапы выполняются со 100 мкг белка в соответствии с инструкциями производителя. Все антитела αNFAT2 используются в разведении 1:1000, антитела GAPDH - в разведении 1:10000. Примерное изображение фиксированных образцов из клеток Jurkat с подходящими и неподходящими антителами показано на рисунке 1.
6. Ресуспендируйте клеточную таблетку в 5 мл коммерчески доступного буфера для лизиса 1 путем пипетирования вверх и вниз. Затем поместите образцы на лед на шейкер и инкубируйте их в течение 10 минут, встряхивая.
   заметка: Перед лизисом клетки могут быть дезинтегрированы в течение 10 с в жидком азоте. Это полезно для клеток Jurkat, но его следует избегать в первичных образцах пациентов. Для дезинтеграции поместите пробирки объемом 5 мл на 5 с в 5-10 мл жидкого азота в специальную емкость. Надевайте защитные очки и соответствующие защитные перчатки.
7. Затем центрифугируйте пробирки при давлении 500 x g в течение 5 мин при 4 °C и осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования.
8. Гомогенизируйте клетки в 5 мл коммерчески доступного буфера для лизиса 2 путем пипетирования вверх и вниз и инкубируйте в течение 10 минут на льду при встряхивании. Затем центрифугируйте пробирки при давлении 500 x g в течение 5 мин при 4 °C и осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования.
9. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл (клетки Юрката) или 140 мкл (образцы пациента) буфера для сдвига 1, содержащего 1x ингибитор протеазы (5 мкл или 1,4 л соответственно) и инкубируйте смесь в течение 10 минут на льду.
10. Для сдвига хроматина перенесите 140 мкл клеточной суспензии с шага 1.9 в пробирки ультразвукового аппарата (избегайте образования пузырьков воздуха и повторите этот шаг, если это необходимо из-за объема образца). Поместите пробирки в сфокусированный ультразвуковой аппарат при температуре 7 °C и срежьте в течение 10 мин (клеточная линия) или 7,5 мин (образцы пациента) со средней мощностью падения 9,375 Вт для получения фрагментов ДНК массой 200-500.о.
11. Наконец, центрифугируйте при 15700 x g в течение 10 мин при 4 °C в малой центрифуге и соберите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 1,5 мл.
12. Чтобы проверить соответствующие размеры фрагментов, проанализируйте 20 мкл срезанного хроматина с помощью гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле TBE. Примерное изображение сдвигового хроматина из клеток Jurkat хорошего и плохого качества показано на рисунке 2. На этом этапе протокол потенциально может быть приостановлен. Срезанный хроматин следует хранить при температуре -80 °C.

Результаты

Рисунок 1: Примеры эффективности антител в фиксированных клетках Jurkat, оцененных с помощью SDS-PAGE и Western-Blot. (a) Клетки Jurkat фиксировали в течение 0 мин (полосы A и D), 2,5 мин (полосы B и E) или 5 мин (C и F) и сравнивали αантитела NFAT2 (клон 7A6) от разных производителей (полосы A-C = производитель 1, полосы D-F = производитель 2). Антитело произ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
37 % Формальдегид в год, ACS	Рот	4979.1
1 х ПБС	Сигма Олдрич	Д8537
Шейкер для туб 1,5 мл Themomixer comfort	Эппендорф	5355 000.011	Может быть заменен аналогичными инструментами
M220 Сфокусированный ультразвуковой аппарат	Коварис	500295
Рабочий буфер 20X Bolt MES SDS	Термо Сайентиал	В0002
Трис буферизованный физиологический раствор (TBS-10X)	Клеточная сигнализация	#12498
Устройство для переноса геля iBlot 2	Термо Сайентиал	IB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, нитроцеллюлоза, обычный размер	Термо Сайентиал	В23001
большая центрифуга	Эппендорф	5804Р	Может быть заменен аналогичными инструментами
Пробирка DNA LoBind 1,5 мл	Эппендорф	22431021
Коктейль из ингибиторов протеазы и фосфатазы Stop (100X)	Термо Сайентиал	78440
Малая центрифуга	Термо Сайентиал	Герей Фреска 17
Градиент плотности среды Biocoll (Плотность 1,077 г/мл)	Мерк	Л 6115