Иммунопреципитация хроматина: методика изучения белок-ДНК-взаимодействий в клетках

Аннотация

Источник: Fuchs, A. R.,et al. A Анализ иммунопреципитации хроматина для идентификации новых генов-мишеней NFAT2 при хроническом лимфоцитарном лейкозе. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео описывает протокол иммунопреципитации хроматина (ChIP), который является классическим методом демонстрации взаимодействия белка и ДНК. Этот метод используется для идентификации генов-мишеней в клетках хронического лимфоцитарного лейкоза человека.

Протокол

1. Иммунопреципитация хроматина

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунопреципитация хроматина проводилась с помощью коммерчески доступного набора ChIP в соответствии с инструкциями производителя с модификациями.

1. Рассчитайте количество иммунопреципитаций (70 мкл (клетки Юрката) или 15 мкл (образцы пациента) спаренного хроматина плюс одно антитело) и приготовьте 20 мкл покрытых белком А гранул на одну осадку в пробирке объемом 1,5 мл. Промойте шарики в 40 мкл 1x буфера ChIP 1 на осаждение пипетированием вверх и вниз, дайте шарикам постоять в магнитном штативе в течение 1 минуты и удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования. Выполните этот шаг в общей сложности четыре раза. В конце концов, снова суспендируйте бусины в исходном объеме с помощью 1x буфера ChIP 1.
2. Для самой иммунопреципитации используют 10 мкг антитела αNFAT2 (7A6) для захвата NFAT2 с его связанными последовательностями-мишенями. Используйте 2,5 мкг антитела IgG кролика (DA1E) в качестве контроля IgG. Готовьте реакции в свежих пробирках объемом 1,5 мл, как указано в таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола важно использовать моноклональное антитело с высокой аффинностью, эпитоп которого не маскируется во время фиксации. Поликлональные антитела вносят дополнительный уровень вариации, что значительно затрудняет адекватную интерпретацию полученных результатов.
3. Инкубируйте смесь с шага 1.2 в течение ночи при температуре 4 °C на вращающемся колесе при 6 оборотах в минуту.
4. На следующий день вращайте пробирки в течение 5 с при давлении 7000 x g в маленькой центрифуге, инкубируйте их в магнитном штативе в течение 1 минуты и удаляйте надосадочную жидкость путем аспирации. Промойте шарики один раз с каждым из буферов промывки 1, 2, 3 и 4 подряд.
5. Для этого суспендируйте шарики в 350 мкл промывочного буфера и инкубируйте их в течение 5 минут при температуре 4 °C на вращающемся колесе при 6 оборотах в минуту.
6. После этого вращайте пробирки в течение 5 с при давлении 7000 x g в малой центрифуге. Затем поместите их на 1 минуту в магнитную решетку, удалите надосадочную жидкость и добавьте следующий буфер для стирки.
7. После последнего этапа промывки удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования, возьмите шарики в 100 мкл элюирующего буфера 1 и инкубируйте их в течение 30 минут на вращающемся колесе при 6 оборотах в минуту.
8. Коротко поверните пробирки (5 с при 7000 x g в маленькой центрифуге) и поместите их в магнитный штатив на 1 минуту.
9. Затем перенесите надосадочную жидкость методом пипетирования в новую пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 4 мкл элюирующего буфера 2.
10. Чтобы создать входной контроль, смешайте 1 мкл сдвигового хроматина с 99 мкл элюирующего буфера 1 и 4 мкл элюирующего буфера 2 (в этой конфигурации на одного пациента приходится три пробирки: один входной контроль, один IgG-контроль и один образец αNFAT2).
11. Инкубируйте образцы в течение 4 ч при 65 °C и 1300 об/мин в шейкере объемом 1,5 мл. Добавьте 100 мкл 100% изопропанола, вортекс и вращайте образцы в течение 5 с при 7000 x g в небольшой центрифуге.
12. Повторно суспендируйте имеющиеся магнитные шарики путем тщательного вортексирования, добавьте 10 μл шариков в каждый образец и инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре на вращающемся колесе со скоростью 6 оборотов в минуту.
13. После инкубации вращайте пробирки в течение 5 с при давлении 7000 x g в маленькой центрифуге и поместите их на 1 минуту в магнитный штатив. Удалите надосадочную жидкость путем аспирации.
14. Суспендируйте шарики в 100 μл буфера для стирки 1. Переверните пробирки для перемешивания и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре на вращающемся колесе со скоростью 6 оборотов в минуту.
15. Вращайте пробирки в течение 5 с при давлении 7000 x g в маленькой центрифуге, поместите их на 1 мин в магнитный штатив и удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования. Повторите шаги 2.13-2.14 с буфером для промывки 2.
16. Затем удалить промывочный буфер путем аспирации, повторно суспендировать шарики в 55 мкл элюирующего буфера и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре на вращающемся колесе при 6 об/мин для элюирования осажденной ДНК. Наконец, вращайте пробирки в течение 5 с при давлении 7000 x g в маленькой центрифуге, поместите их на 1 мин в магнитный штатив и перенесите надосадочную жидкость в новые пробирки объемом 1,5 мл><. заметка: Здесь протокол потенциально может быть поставлен на паузу. Затем элюированную ДНК следует хранить при температуре -20 °C.

пункт	объем (μл) на IP
5% BSA	6
100 х ингибитор протеазы	3
5 x буфер CHIP 1	56
сдвиговый хроматин	x (15 μL или 70 μL)
Магнитные шарики, покрытые протеином А	20
Вода класса ChIP seq	185-х-у
антитела (αNFAT2 или IgG-контроль)	y (1,09 мкл или 1 мкл)
итог	270

Таблица 1: График пипетирования иммунопреципитации хроматина. Иммунопреципитацию хроматина проводили путем приготовления реакций, как указано в таблице.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Антитела к NFAT2	Алексис	1008505	Клон 7А6
Антитела к NFAT2	Клеточная сигнализация	8032С	Клон D15F1
Антитела к NFAT2 класса ChIP	Абкам	АБ2796	Клон 7А6
Магнитная стойка, магнит DynaMag-15	Термо Сайентиал	12301Д	Может быть заменен аналогичными инструментами
Комплект iDeal ChIp-seq для гистонов	Диагенод	C01010059
Малая центрифуга	Термо Сайентиал	Герей Фреска 17	Может быть заменен аналогичными инструментами
Шейкер Duomax 1030	Инструменты Heidolph	Тел.: 543-32205-00	Может быть заменен аналогичными инструментами
Коктейль из ингибиторов протеазы и фосфатазы Stop (100X)	Термо Сайентиал	78440
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0,5 мг	LI-COR Биологические науки	926-68023
IRDye 800CW Goat антимышиный IgG (H + L), 0,1 мг	LI-COR Биологические науки	925-32210 (английский)
Пробирка DNA LoBind 1,5 мл	Эппендорф	22431021
FBS superior	Мерк	С0615
37 % Формальдегид в год, ACS	Рот	4979.1
1 х ПБС	Сигма Олдрич	Д8537
M220 Сфокусированный ультразвуковой аппарат	Коварис	500295
Рабочий буфер 20X Bolt MES SDS	Термо Сайентиал	В0002
Трис буферизованный физиологический раствор (TBS-10X)	Клеточная сигнализация	#12498
Устройство для переноса геля iBlot 2	Термо Сайентиал	IB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, нитроцеллюлоза, обычный размер	Термо Сайентиал	В23001
большая центрифуга	Эппендорф	5804Р	Может быть заменен аналогичными инструментами

Кабель