Культивирование и заготовка клонов HSPC: способ получения односортированных клонов HSPC

Аннотация

Источник: Huber, A. R., et al. Характеристика мутационной нагрузки и клонального состава крови человека. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео описывается протокол выделения ГСКК из костного мозга и их сортировки с использованием метода сортировки флуоресцентных активированных клеток, который представляет собой метод получения отдельно отсортированных ГСК. Мы культивируем эти отсортированные клетки для получения клонов HSPC.

Протокол

1. Изоляция, сортировка и культура HSPC

1. Вращайте вниз при 1–2 x 10⁷ мононуклеарах в течение 5 мин при 350 x g и ресуспендируйте в 50 мкл буфера FACS. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл раствора анти-CD3 окрашивания (1:100 разведение анти-CD антитела в буфере FACS). Перенесите ячейки в микроцентрифужную пробирку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При сортировке с >2 x 10⁷ клетками соответственно увеличьте объем смеси антител и буфера FACS.
2. Приготовьте 50 мкл смеси для окрашивания 2x HSC в соответствии с рецептом, приведенным в таблице 1
3. Смешайте 50 мкл клеточного раствора с приготовленной смесью для окрашивания HSC и инкубируйте клетки в течение 15 мин при комнатной температуре (RT) или в течение 1 ч на льду для связывания антител.
4. Промойте ячейки, добавив 1 мл буфера FACS и гранул центрифугированием в течение 5 минут при 350 x g.
5. Повторно суспендируйте клетки в 300 мкл буфера FACS и отфильтруйте клеточную суспензию через полистирольную трубку объемом 35 мкм с сетчатым фильтром объемом 5 мл, чтобы удалить клеточные комки перед флуоресцентно-активируемой сортировкой клеток (FACS).
6. Приготовьте 25 мл питательной среды HSPC, состоящей из 1x SFEM среды с добавлением 100 нг/мл SCF, 100 нг/мл Flt3, 50 нг/мл ТПО, 10 нг/мл IL-3, 20 нг/мл IL-6 и 100 нг/мл антибиотика (см. Таблицу материалов).
7. Заполните 384-луночный планшет для культивирования клеток 75 мкл питательной среды HSPC в каждой лунке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить испарение среды во внешних лунках, заполните внешние лунки 75 мкл стерильной воды или PBS и не используйте эти лунки для сортировки клеток.
8. Сортировка одиночных HSPC
   1. Установите затворы для сортировки ГСКХ на основе неокрашенного контроля (отдельно отсортированные ГСК) и 10 000 клеток из окрашенного образца. Репрезентативный результат установки стробов показан на рисунке 1. Затвор одиночных ячеек путем рисования строба вокруг линейной FSC-высоты в зависимости от доли FSC-площади. Используйте неокрашенную контрольную фракцию для рисования ворот для ^{lineage-fraction}. Нарисуйте вентили для клеток CD34⁺ и дополнительно охарактеризуйте это подмножество, установив специальный вентиль для клеток CD38-CD45RA-.
   2. Загрузите планшет на 384 лунки на станок FACS и отсортируйте отдельные ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если это применимо к машине FACS, включите опцию сохранения данных сортировки индекса, чтобы включить повторную трассировку отсортированных ячеек.
9. Культивирование односортовых ГСК
   1. Непосредственно переместите планшет на 384 лунки в увлажненный инкубатор с температурой 37 °C и 5% CO₂,
      заметка: Для предотвращения испарения во время культивирования оберните культуральную пластину 384 лунки (с крышкой) в прозрачную полиэтиленовую пленку.
   2. Держите планшет 384 лунки в инкубаторе в течение 3–4 недель, пока не появятся видимые клоны. Репрезентативные образы клональной культуры изображены на рисунке 2. В зависимости от состояния исходного материала 5–30% отсортированных клеток будут клонально расширяться.

мм

антитело	объем [μл]
БВ421-КД34	5
Микс FITC-Lineage (CD3/14/19/20/56)	5
ПЭ-КД38	2
БТР-CD90	0,5
PerCP/Cy5.5 - CD45RA	5
PE/Cy7- CD49f	1
ФИТК-CD16	1
ФИТК-КД11	5
Буфер FACS	25,5

Таблица 1: Сортировочная смесь HSC.Показана таблица с указанием разведений антител, используемых для сортировки ГСК.

2. Сбор клонов HSPC

1. После 4 недель культивирования определите, какие лунки имеют слияние 30% или выше.
2. Предварительно заполните (для каждого клонального выроста) 1,5 мл микропробирок 1 мл 1% BSA в PBS и пометьте пробирку в соответствии с соответствующей лункой.
3. Предварительно смочите наконечник пипетки 1% BSA в PBS, чтобы свести к минимуму количество клеток, прилипших к наконечнику пипетки.
4. Яростно пипетируйте вверх/вниз по среде в лунке (не менее 5 раз) с помощью пипетки объемом 200 мкл (установленной на 75 мкл) и соскребите дно лунки, чтобы разрыхлить клетки в лунке, и соберите клеточную суспензию в меченую микропробирку, соответствующую лунке.
5. Возьмите 75 мкл свежего 1% BSA в PBS и повторите пипетирование в лунке для обеспечения максимального поглощения клетками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клонально культивируемые клетки могут прилипать ко дну лунки. Осмотрите лунки с помощью стандартного микроскопа с инвертированным светом, чтобы убедиться, что все клетки были собраны.
6. Если все лунки со сливаемостью >30% были собраны, поместите планшет на 384 лунки обратно в инкубатор. Клональные культуры могут размножаться до 5 недель.
7. Уменьшите клеточную суспензию в течение 5 минут при 350 x g. Должна быть видна небольшая лепешка.
8. Осторожно удалите все надсадочную жидкость, кроме примерно 5 μл. Клеточные гранулы можно замораживать при температуре -20 °C и хранить в течение нескольких месяцев до выделения ДНК.

Результаты

Рисунок 1: Блок-схема, изображающая экспериментальную процедуру на основе исходного материала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
CD11c FITC	Биолегенда	301603	Клон 3.9
CD16 FITC	Биолегенда	302005	Клон 3G8
CD3 BV650	Биолегенда	300467	Клон UCHT1
КД34 БВ421	Биолегенда	343609	561
СД38 ПЭ	Биолегенда	303505	Клон HIT2
CD45RA PerCP/Cy5.5	Биолегенда	304121	Клон HI100
CD49f PE/Cy7	Биолегенда	313621	Клон GoH3
БТР CD90	Биолегенда	328113	Клон 5Э10
Клеточное ситечко 5 мл туба	Корнинг	352235
Тарелка CELLSTAR, 384 вт, 130 μл, F-образное дно, TC, крышка	Грейнер	781182
Человеческий Flt3-лиганд, премиум класс	Милтеньи Биотех	Тел.: 130-096-479	Реконституция в аликвотах однократного применения (25 μл) в концентрации 100 μг/мл в 0,1% BSA в PBS
Человеческий рекомбинантный IL-3 (E. coli-экспрессированный)	Технологии стволовых клеток	78040.1	Реконституция в одноразовых аликвотах (2,5 мкл) в концентрации 100 мкг/мл в 0,1% БСА в PBS
Человеческий рекомбинантный IL-6 (E. coliexpressed)	Технологии стволовых клеток	78050.1 Материал 78050.1	Реконституция в одноразовых аликвотах (5 μл) в концентрации 100 μг/мл в 0,1% BSA в PBS
Человеческий SCF, премиум класс	Милтеньи Биотех	Тел.: 130-096-695	Реконституция в аликвотах однократного применения (25 μл) в концентрации 100 μг/мл в 0,1% BSA в PBS
ТПО человека, премиум класс	Милтеньи Биотех	Тел.: 130-095-752	Реконституция в одноразовых аликвотах (12,5 мкл) в концентрации 100 мкг/мл в 0,1% БСА в PBS
Родословная (CD3/14/19/20/56) FITC	Биолегенда	348701	Клоны: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
ПБС			Изготовлено в помещении института. Также можно использовать коммерчески доступную PBS
Примоцин	Инвивоген	АНТ-ПМ-1	Рецептура антибиотика

Сталь