$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
Выделение клеток c-Kit+ из костного мозга
- Принесите мышей в жертву в соответствии с институциональными рекомендациями.
Примечание: Здесь мыши подвергались воздействию углекислого газа (CO2) с рекомендованной AVMA скоростью потока до тех пор, пока смерть не определялась прекращением дыхания и сердцебиения с последующим вывихом шейки матки.
- Соберите у мыши кости ног — две бедренные кости, две голени, две подвздошные. Очистите все ткани от костей, соскоблив их скальпелем. Положите кости ног в холод 1х ПБС на лед — 5 мл в пробирке объемом 15 мл. Высыпьте содержимое тюбика в ступку и раздавите ее пестиком.
- С помощью пипетки отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатый фильтр 70 μм в пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 50 мл с прикрепленной пипеткой объемом 10 мл. Промойте ступку и несколько раз пестиком холодным 1x PBS, собирая и добавляя клеточную суспензию в пробирку объемом 50 мл. Вращайте костный мозг при 1 200 x g при 4 °C в течение 5 минут. Удалите надосадочную жидкость с помощью вакуума с прикрепленной стеклянной пипеткой. Суспендируйте клеточную гранулу в 5 мл 1x PBS с помощью пипетки.
- С помощью пипетки медленно добавьте во взвешенный костный мозг до верха 5 мл полисахарозы комнатной температуры (температура критическая), стараясь не нарушить границу раздела. Вращайте при 400 x g при комнатной температуре в течение 20 минут с выключенным тормозом.
- Соберите мутную общую моноядерную ячейку (TMNC) с помощью пипетки и поместите ее в новую пробирку объемом 15 мл. Доведите объем до 10 мл с 1x PBS для стирки, взяв 20 μL для подсчета, и отжимайте при 1 200 x g при 4 °C в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и оставьте гранулу на льду для шага 4.6.1.
- Выполните выделение клеток c-Kit+.
- Следуйте протоколу набора микрогранул для выделения клеток c-Kit+. Ресуспендируйте клеточную таблетку в 80 мкл 1x PBS + EDTA + BSA до 107 клеток. К клеточной суспензии добавьте 20 μL CD117 MicroBeads/107 всего клеток. Хорошо перемешайте вортексом и инкубируйте в течение 10 минут при 4 °C. Доведите объем до 10 мл, добавив 1x PBS + EDTA + BSA, и отвертите при 1 200 x g при 4 °C в течение 5 минут.
- Удалите надосадочную жидкость с помощью вакуума и суспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл/10 всего8 клеток в 1x PBS + EDTA + BSA. Используя магнитную подставку с прикрепленной магнитной колонкой, добавьте 3 мл 1x PBS + EDTA + BSA и дайте ему течь под действием силы тяжести в сборную пробирку объемом 15 мл.
- После того, как первый буфер пройдет через колонку, добавьте суспензию клеток в колонку, позволив ей протекать под действием силы тяжести в пробирку для сбора объемом 15 мл. Этот протекание и есть нежелательная клеточная фракция.
- Промойте колонку 3 раза 3 мл 1x PBS + EDTA + BSA каждый раз, позволяя ему течь под действием силы тяжести в сборную трубку. Снимите колонку с магнита и поместите ее на верхнюю часть пробирки объемом 15 мл.
- Добавьте 5 мл 1x PBS + EDTA + BSA и немедленно промойте его с помощью поршня, прилагаемого к колонке. Снимите поршень и повторите промывку с дополнительными 5 мл 1x PBS + EDTA + BSA. Посчитайте ячейки в общем объеме с помощью стандартных методов.
- Понизьте температуру клеток при 1200 x g при 4 °C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в полном IMDM (IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 нг/мл] + mSCF [50 нг/мл] + лиганд FLT3 [20 нг/мл] + IL-3 [10 нг/мл]) для посева. Культивируйте эти клетки в течение ночи в 2 x 106 клеток/1 мл полной среды IMDM, поместив их в инкубатор при 37 °C и 5%CO2.