Ретровирусно-опосредованная трансдукция: метод введения гена-мишени в раковые клетки

Аннотация

Источник: Кесарвани, М., и др. Методы оценки роли c-Fos и Dusp1 в онкогенной зависимости. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео описывает протокол генетической валидации путем переноса генов-мишеней с использованием ретровирусов в клеточных линиях хронического миелоидного лейкоза. Ретровирусы действуют как медиатор для переноса генетического материала в клетки лейкемии посредством процесса, называемого трансдукцией, который обеспечивает долгосрочную экспрессию гена-мишени. Этот метод может быть применен к любым клеткам-мишеням для генетической валидации и терапевтической разработки.

Протокол

1. Трансдукция

1. Трансфекция ретровирусной плазмиды
   1. Свежеразмораживайте клетки HEK293 накануне во второй половине дня на водяной бане, установленной на 37 °C. Вращайте криотрубку, содержащую клетки HEK, при температуре 435 x g при комнатной температуре в течение 3 мин. Удалите надосадочную жидкость с помощью вакуума и суспензируйте клеточную гранулу в 1 мл DMEM с добавлением 10% FBS, пенициллина, стрептомицина и глутамина.
   2. Посчитайте ячейки и добавьте соответствующий объем в обработанную посуду размером 10 см (~4 x 10⁶ HEK293T ячеек). Добавьте в форму 14 мл среды DMEM 10 и хорошо перемешайте, проводя вверх и вниз для равномерного распределения. Поместите чашку в инкубатор с температурой 37 °C, 5%_CO2 на ночь.
   3. На следующее утро проверьте слияние клеток под микроскопом с инвертированным светом (хорошо работает 50% и более).
   4. Объедините ДНК (желаемую ретровирусную плазмиду), PclEco (упаковочную плазмиду), 2 M CaCl₂ и H₂0 в пробирке объемом 1,5 мл (= 500 мкл) с помощью микропипетки в следующих количествах: 7,5 мкг ДНК (BCR-ABL1-YFP), 7,5 мкг pCLeco, 62 мкл 2 M CaCl₂ и воду до конечного объема 500 мкл. Добавьте 500 мкл 2x HBS в другую пробирку объемом 1,5 мкл.
   5. Добавьте смесь ДНК по каплям в 1,5 мл пробирки, содержащей 500 мкл 2x HBS (280 мМ NaCl, 100 мМ HEPES и 1,5 мМ Na₂HPO₄) во время смешивания. Для этого установите вихрь на самую низкую скорость и удерживайте на нем трубку HBS для постоянного перемешивания при добавлении трансфекционной смеси.
   6. Дайте трансфекционной смеси понервироваться в течение 20–30 минут при комнатной температуре. Во время инкубации добавьте 25 нМ хлорохина в клетки HEK и поместите их обратно в инкубатор. После инкубации добавьте трансфекционную смесь по каплям в клетки HEK, а затем осторожно перемешайте среду, чтобы перемешать трансфекционную смесь по всей пластине.
   7. Инкубируйте клетки со смесью в течение ~8 часов в инкубаторе с температурой 37 °C, 5%_CO2. Меняйте среду на этих клетках, очень медленно добавляя 14 мл свежей среды DMEM 10. Медленное пипетирование к стенке чашки помогает предотвратить любое удаление клеток HEK. Инкубируйте клетки в течение ночи в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO₂.
   8. Соберите вирусную надосадочную жидкость с помощью шприца объемом 10 мл, наберите надосадочную жидкость в шприц и прикрепите шприцевой фильтр 0,45 мкм. Погрузите вирусную надосадочную жидкость в новую пробирку для сбора. Примите первый сбор вирусного надосадочной жидкости через ~16 часов.
2. Концентрация и трансдукция фибронектина в вирусах
   1. Добавьте 2 мл 0,1 мг рекомбинантного фрагмента фибронектина человека в 1x PBS в необработанные 6-луночные культуральные планшеты. Готовят столько фибронектина, сколько нужно, что зависит от количества клеток и генотипов. Одна лунка может в достаточном объеме трансдуцировать 10 миллионов клеток c-Kit+. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 4 °C.
   2. На следующий день удалите фибронектин из лунок с помощью пипетки, пипеткой внесите 2 мл стерильного 2% BSA в 1x PBS для блокировки планшета и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Извлеките BSA с помощью пылесоса и тщательно промойте его пипетированием 2 мл 1x PBS, затем удалите его с помощью пылесоса.
   3. Немедленно добавьте свежесобранную и отфильтрованную (в 0,45 мкм) вирусную надосадочную жидкость до 5 мл. Центрифуга при 435 x g при 32 °C в течение 2 ч. Удалите надосадочную жидкость с помощью вакуума и повторите этот шаг с дополнительным свежесобранным вирусным надосадочным веществом и повторите вращение. Удалите надосадочную жидкость с помощью пылесоса и промойте лунки, добавив 2 мл 1x PBS; Затем удалите его с помощью пылесоса.
   4. Добавьте клетки мыши c-Kit+, которые были культивированы в течение ночи, путем вращения клеток и повторного суспендирования гранулы в полном IMDM для культивирования. Культивируйте эти клетки в течение ночи в 2 x 10⁶ клеток/1 мл полной среды IMDM, поместив их в инкубатор при 37 °C и 5% CO₂) в лунки, покрытые вирусом, хорошо перемешав клеточные суспензии и пипетируя их в теперь уже вирусную концентрированную фибронектиновую пластину. Вращайте при температуре 1 200 x g при 25 °C в течение 90 минут. Поместите клетки в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2.
   5. Через 48 ч после трансдукции гранулировать клетки центрифугированием при 1200 x g при 4 °C в течение 5 мин и повторно суспендировать их в буфере FACS #1 (1x PBS + 0,5% BSA) до 6 x 10⁶/мл. Определите процент BCR-ABL1-положительных клеток путем измерения процента YFP-положительных клеток с помощью проточной цитометрии.
   6. Получение событий с помощью стандартной процедуры. Во-первых, затворите живые ячейки на основе прямого и бокового разброса. Затем забирают YFP-положительные живые клетки, исключая YFP-отрицательные клетки, определенные отрицательным контролем (рис. 1).

Результаты

Рисунок 1: FACS, показывающий частоту клеток YFP+ из крови трансплантированной мыши и мыши WT (отрицательный контроль). На верхних панелях отображается точечная диаграмма ячеек и строб. На нижних панелях отображаются гистограммы зависимости YFP от бокового рассеяния. Клетки с MFI >103 рассматривались как YFP+. Аналогичное гейтирование б...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-ЧВ
Фрагмент реконбинантного фибронектина человека рекомбинантный	Такара	Т100Б
ФБС	Атланта биологическая	С11150
Пенн/стрептококк	Cellgro (corning)	30-002-КИ
L-глютамин	Cellgro (corning)	25-005-КЛ	Запас 5 мг/мл в воде
ХЕПЕС	сигма	Н7006
ПБС	Корнинг	21040С.В.
Na2HPO4.7H2O	сигма	С9390
Хлорид кальция	Инвитроген	K278001
2x HBS	Инвитроген	K278002
Эдта	Амбион	АМ9261
БСА	сигма	А7906
Долгосрочный анализ клеток человека, инициирующий культуру	Технологии Stemp Cell
Автоматический счетчик ячеек TC-10	Био-РАД
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/-	Сделано на собственном предприятии
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Сделано на собственном предприятии
ROSACreERT2	Лаборатория Джексона
С57Bl/6	Лаборатория Джексона
ХМЛ-CD34+ и нормальные CD34+ клетки	Университетская больница, Университет Цинциннати
LSR II (FACS анализатор)	БД
Fortessa I (анализатор FACS)	БД
FACSAriaII (сортировщик FACS)	БД
NAPCO серия 8000 WJ CO2	Термонаучная
Ротор поворотного ковша cetrifuge 5810R	Эппендорф
1/2 мл Lo-Dose u-100 инсулиновый шприц 28 G1/2	Бектон Дикинсон	Бектон Дикинсон
Гидрокортизон гемисукцинат натрия	Технологии стволовых клеток	7904
GM-CSF	Проспек	ЦИТ-221
G-SCF	Проспек	ЦИТ-220
Человек Ил-3	Проспек	ЦИТ-210
СКФ человека	Проспек	ЦИТ-255
Эритропоэт	Компания «Амджен»	5513-267-10
BD Perm/Wash (раствор для пермеабилизации и промывки для потока фосфоса)	БД	554723
BD Cytofix/Cytoperm (Раствор для фиксации и пермеабилизации)	БД	554714
БД Фарм Лиз	БД	555899
70 μм нейлоновый Stariner	Бектон Дикинсон	No 352350 (Английский
Дисковый фильтр acro 0,45 мкМ	покрывать	2016-10

инкубатор ) гг.