Методическая статья

Анализ КОЕ на основе метилцеллюлозы: метод определения влияния противораковых соединений на образование колоний в лейкозных клетках

30 апреля 2023 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Кесарвани, М., и др. Методы оценки роли c-Fos и Dusp1 в онкогенной зависимости. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео описывается протокол для анализа колоний на основе метилцеллюлозы или КОЕ, который помогает идентифицировать и подсчитать количество колоний, образованных лейкозными клетками в ответ на лечение противораковыми соединениями.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Анализы колониеобразующих единиц

  1. Разморозьте метилцеллюлозу с цитокинами для мышей при комнатной температуре в течение 1–2 ч. Аликвотируйте 3 мл метилцеллюлозы в пробирке FACS с помощью шприца объемом 5 мл без иглы. Отсортируйте YFP-положительные клетки на сортировщике клеток.
  2. Раскрутите ячейки вниз и суспензируйте гранулу в полной среде IMDM. Подсчитайте клетки, которые должны быть покрыты, и разбавьте их для получения 5000 YFP-положительных клеток в 100 мкл полной среды IMDM.
  3. Добавьте 100 мкл клеточной суспензии, содержащей 5000 YFP-положительных клеток и соответствующие ингибиторы, к 3 мл метилцеллюлозы. Вихрь на высокой мощности перемешать в течение 10–30 с.
  4. После того, как большая часть пузырьков воздуха выйдет, используйте шприц объемом 1 мл, чтобы наложить 1 мл среды на три повторяющиеся пластины по 3 см, выбрасывая среду с одной стороны и медленно наклоняя пластину круговыми движениями, чтобы равномерно распределить.
  5. Конечными концентрациями используемых ингибиторов являются иматиниб в дозе 3 мкМ, DFC в дозе 0,2 мкМ и ИМК в дозе 0,5 мкМ, отдельно или в комбинации. Там, где это целесообразно, удалите c-Fos, погасив клетки 4-гидрокситамоксифеном (1 г/мл), добавленным к метилцеллюлозе.
  6. После сервировки поместите тарелки в большую чашку Петри с одной открытой посудой, содержащей 2 мл стерильной воды посередине. Накройте большую чашку Петри крышкой и тщательно инкубируйте при температуре 37 °C, 5%CO2 в инкубаторе. Запишите численность колоний через неделю после нанесения покрытия, подсчитав общее количество колоний под микроскопом.
  7. Проанализируйте несколько колоний из подходящих планшетов для делеции c-Fos методом ПЦР. Соберите колонии, посасывая их с помощью наконечника P1000. Выбейте элементы в 500 мкл 1x PBS, промыв наконечник в PBS несколько раз. Вращайте клеточные суспензии при 6000 x g в течение 1 минуты и извлекайте ДНК из клеточной гранулы с помощью набора для выделения геномной ДНК.
  8. Используйте геномную ДНК для ПЦР с использованием праймеров mFos-FP3 и mFos-RP5. Проанализируйте продукты ПЦР на 2% агарозном геле и изображении с помощью системы документирования геля.
  9. Для графического представления колоний окрашивайте колонии, используя йодонитротетразолия хлорид. Растворите 10 мг йодонитротетразолия хлорида в 10 мл воды до получения раствора 1 мг/мл. Фильтр стерилизуют раствор с помощью замка Люэра с фильтром 0,2 мкм, прикрепленным к шприцу объемом 10 мл в стерильных условиях в капюшоне для культуры тканей.
  10. В капюшон для культуры тканей добавьте 100 мкл красящего раствора по каплям вокруг пластины с КОЕ; будьте осторожны, чтобы не сползти и не потревожить колонии. Инкубируйте планшеты в течение ночи в инкубаторе для клеточных культур с температурой 37 °C и 5%CO2. Колонии приобретут темно-красновато-коричневый цвет. Используя белый фон в капюшоне для культуры стерильных тканей, сфотографируйте окрашенную пластину с КОЕ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ИМДМCellgro (corning)15-016-ССР
MethoCult GF M3434 (Метилцеллюлоза для КОЕ мышей)стволовая клеткаNo 3434
4-гидрокситамоксифенсигмаН6278
Рекомбинантный мышиный SCFПроспекCYT-275
Рекомбинантный мышиный Flt3-лигандПроспекЦИТ-340
Мышиный рекомбинантный ИЛ-6ПроспекЦИТ-350
Мышиный рекомбинантный ИЛ-7Пепротех217-17
DFCLKT Laboratories Inc.Д3420
ИМКChemzon ScientificНЗ-06-195
ИматинибLC LaboratorИ-5508
1x PBSCellgro (corning)21-040-ЧВ
1/2 мл Lo-Dose u-100 инсулиновый шприц 28 G1/2Бектон Дикинсон329461
Йодонитротетразолия хлоридсигмаИ10406
Инструменты
NAPCO серия 8000 WJ CO2Термонаучная
Ротор поворотного ковша cetrifuge 5810RЭппендорф
Термоамплификатор C-1000Био-РАД
ChemiDoc Imaging System (система визуализации гелей и вестерн-блоттинга)Био-РАД17001401
Мышей
ROSACreERT2Лаборатория Джексона
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/Сделано на собственном предприятии
ROSACreERT2/c-Fosfl/flСделано на собственном предприятии
инкубатор

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи